HIV TAT——一种生物大分子的运载体

人工合成编码TAT蛋白转导区核心区域11个氨基酸的双链寡核苷酸,构建pET28a-TAT-LacZ表达子,转化大肠杆菌,得到高表达的TAT-β-Gal融合蛋白。TAT-β-Gal加入体外培养的平滑肌细胞中,15min细胞即出现蓝染,1h TAT-β-Gal 100％进入细胞。该融合蛋白ip到Wistar大鼠体内,30min各组织出现蓝染,4h光密度值达高峰。实验证明TAT蛋白可有效携带大分子物质穿过生物膜,是一良好的生物大分子运载体。

TAT介导的白血病抑制因子受体α亚基胞内区远膜端融合蛋白的制备及其对HL-60细胞生长的抑制作用

目的：克隆表达HIV-1反式激活蛋白TAT与白血病抑制因子（LIF）受体α亚基胞内区C末端序列（LIFRα-CT3）的融合蛋白（TAT-CT3）,并检测其对HL-60细胞增殖的抑制作用.方法：重组构建TAT-CT3和SUMO融合表达质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导SUMO-TAT-CT3融合蛋白表达.表达产物经亲和层析柱纯化、去除SUMO蛋白标签后获得TAT-CT3融合蛋白,免疫印迹鉴定.采用CCK-8法检测HL-60细胞的抑制率.结果：构建了高表达重组子pET28a-SUMO-TAT-CT3,获得了相对分子质量约为26 kD的TAT-CT3融合蛋白.经活性检测,TAT-CT3融合蛋白能有效抑制HL-60细胞的生长.结论：成功地克隆、表达、纯化TAT-CT3融合蛋白,该融合蛋白具有生物活性,可抑制HL-60细胞的增殖.

pTAT-XIAP融合蛋白表达载体的构建

目的探索pTAT-XIAP融合蛋白表达载体的构建。方法在体外合成大鼠XIAP基因,将其插入pTAT-HA质粒,构建pTAT-XIAP融合蛋白表达载体,将pTAT-XIAP质粒转化至DH5α,培养筛选成功转化子,提取纯化质粒,电泳鉴定。结果pTAT-XIAP质粒在含氨苄青霉素的LB固体培养基上呈分散菌落生长,在无氨苄青霉素的LB固体培养基上成片生长,未经质粒转化的DH5α感受态细胞在含氨苄青霉素的LB固体培养基上未见菌落生长。电泳结果显示pTAT-XIAP质粒约4500bp,pTAT-HA质粒约3000bp,条带大小与质粒图谱一致。结论将大鼠XIAP基因插入PTAT-HA质粒,成功构建pTAT-XIAP融合蛋白表达载体。

pET28a-TAT-LacZ重组子的构建

为了构建高表达pET28a-TAT-LacZ重组子,观察表达的融合蛋白TAT-β-Gal能否穿过生物膜,使用人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a组氨酸编码区后再连接lacZ基因,组成pET28a-TAT-LacZ重组表达子,转化大肠杆菌,利用组氨酸亲和层析柱纯化TAT-β-Gal融合蛋白,将融合蛋白加入培养的平滑肌细胞。得到高度纯化的、有活性的TAT-β-Gal融合蛋白,TAT-β-Gal在短时间内进入体外培养平滑肌细胞,成功地构建了高表达pET28a-TAT-LacZ重组子,并在体外培养的细胞中证实TAT-β-Gal融合蛋白穿透生物膜的能力,为肽类、生物大分子药物进入组织细胞内发挥治疗作用提供了理论基础。

TAT-NDPK-A蛋白的构建表达及穿膜初步研究

目的构建pET-TAT-nm23-H1质粒,表达TAT-核苷二磷酸激酶A(TAT-nucleoside diphosphate kinase A,TAT-NDPK-A)融合蛋白,并研究融合蛋白穿膜进入A549细胞。方法人工合成编码TAT蛋白转导区域的11个氨基酸序列于NDPK-A引物的上游,PCR扩增后将融合基因克隆到pET28(a)原核表达载体上,经IPTG诱导表达、镍离子树脂色谱纯化TAT-NDPK-A蛋白,Westen-blot鉴定分析重组蛋白的抗原性,将TAT-NDPK-A蛋白加入到A549细胞中,荧光免疫组化检测蛋白穿膜进入细胞内。结果TAT序列与NDPK-A正确融合并插入pET28(a)载体上,经诱导表达纯化成功获得纯度为97%的TAT-NDPK-A蛋白,在培养的A549细胞中加入重组蛋白4 h后在细胞内检测到穿膜的蛋白。结论构建表达TAT-NDPK-A蛋白,TAT序列能够引导重组蛋白穿过细胞膜进入细胞内,为进一步研究基因的功能奠定了基础。

Tat-GFP融合蛋白的表达纯化及其穿膜活性

目的:获得具备穿膜活性与绿色荧光蛋白(GFP)标记的Tat-GFP融合蛋白,探讨Tat-GFP在MCF-7细胞中的跨膜转运特性。方法:应用pET-24a-Tat-GFP质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,检测不同异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度(0.5和1.0mmol·L-1)和不同温度(22℃和37℃)诱导融合蛋白的表达情况;利用Ni-IDA树脂亲和纯化Tat-GFP蛋白,利用GFP特异性抗体采用Western blotting法分析洗脱液中的蛋白;激光共聚焦荧光显微镜下检测Tat-GFP融合蛋白的跨膜转运活性。结果:0.5和1.0mmol·L-1 IPTG诱导出的细菌总蛋白中所含的Tat-GFP蛋白量无明显差异;低温(22℃)诱导生产的Tat-GFP蛋白量较37℃更高;Western blotting分析,GFP抗体能够特异性识别PVDF膜上的蛋白,条带灰度与Tat-GFP蛋白上样量有关联;细胞穿膜实验,绿色荧光分布于MCF-7细胞的细胞质和细胞核中。结论:低温诱导时大肠杆菌BL21菌体上清液中Tat-GFP融合蛋白量更高,所生产的Tat-GFP融合蛋白既具备穿膜活性又具有易于检测的绿色荧光。

TAT-EGFP融合蛋白的表达及在PC12细胞的转导活性

目的构建pET28a-TAT-EGFP重组子,观察表达的融合蛋白TAT-EGFP在细胞内的转导活性.方法人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a后再连接EGFP基因,组成pET28a-TAT-EGFP重组表达子.转化大肠杆菌,IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达,组氨酸亲和层析柱纯化.将融合蛋白加入培养的PC12细胞,观察荧光进入细胞的情况.结果成功地构建了高表达pET28a-TAT-EGFP重组子,纯化了分子质量约为29ku的融合蛋白TAT-EGFP,并在体外培养的PC12细胞中证实TAT-EGFP融合蛋白穿透生物膜的能力.结论通过对TAT-EGFP融合蛋白的表达纯化及活性分析,证实了TAT的蛋白转导作用,为肽类及生物大分子药物进入组织细胞内发挥治疗作用提供了理论基础.

TAT-EGFP融合蛋白表达载体的构建及表达

目的构建TAT-EGFP原核表达载体,在E.coliBL21中高效表达并纯化。方法人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a后得到pET28a-TAT重组质粒,再连接绿色荧光蛋白(EGFP)基因,组成pET28a-TAT-EGFP重组表达子。转化大肠杆菌,IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达。表达产物用十二烷基硫钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白。结果及结论成功地构建了TAT-EGFP融合蛋白的原核表达载体,在诱导后获得了高效表达并纯化,为进一步研究TAT的蛋白转导作用奠定了基础。

融合蛋白TAT-EGFP的表达及其对膀胱癌细胞和组织的穿膜活性鉴定

目的构建穿膜肽-增强型绿色荧光蛋白(TAT-EGFP)融合蛋白的原核表达系统,研究该融合蛋白在体外对人膀胱癌细胞(EJ细胞)和膀胱癌组织的跨膜作用。方法以pEGFP-1载体为模板,设计包含TAT序列的引物,用PCR技术扩增TAT-EGFP基因,扩增产物插入载体pET30a,构建成重组质粒pET30a-TAT-EGFP。将重组质粒转入大肠杆菌BL21中,IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达。表达产物用十二烷基硫钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,Ni-NTA Superflow Cartvidge亲和层析柱纯化融合蛋白。将融合蛋白TAT-EGFP加入培养的EJ细胞和膀胱癌组织,荧光显微镜观察TAT-EGFP融合蛋白进入EJ细胞和膀胱癌组织的情况。结果成功构建了高表达pET30a-TAT-EGFP重组子,纯化了分子质量约为31 kD的融合蛋白TAT-EGFP。不同浓度的TAT-EGFP融合蛋白对膀胱癌细胞均无明显毒性。TAT-EGFP融合蛋白具有穿过膀胱癌细胞和膀胱癌组织的作用。结论通过对TAT-EGFP融合蛋白表达纯化及活性分析,证实TAT的蛋白转导作用,为肽类及生物大分子药物进入组织细胞内发挥治疗作用提供了理论基础。

GST-TAT-GFP融合蛋白的表达、纯化及鉴定

目的获得融合TAT短肽的融合蛋白GST-TAT-GFP,以用于阐明TAT短肽的跨膜递送机理。方法以质粒pGEX-GFP为模板,扩增目的基因TAT-GFP,将其克隆至质粒pGEX-2T,用所构建的质粒pGEX-TAT-GFP转化大肠杆菌BL21并诱导表达,利用GS-4B亲和柱进行纯化,所得产物进行SDS-PAGE、Western blot及细胞跨膜实验鉴定。结果大肠杆菌细胞经诱导高效表达出约54.3 kD的蛋白,其相对分子质量与GST-TAT-GFP融合蛋白相符;Western blot显示该融合蛋白能够被抗GFP的抗体特异性识别;细胞实验表明融合TAT短肽的融合蛋白能跨膜进入细胞L-02、SMMC-7721、Hela和BEL-7402。结论在大肠杆菌表达系统中高效表达了有活性的GST-TAT-GFP融合蛋白。

TAT蛋白转导结构域介导融合蛋白在小鼠活体的跨膜递送作用

目的探讨跨膜递送短肽——TAT蛋白转导结构域(简称TAT)介导的与其融合的活性蛋白在活体的跨膜递送作用。方法以融合蛋白GST-TAT-GFP,GST-GFP-TAT和GST-GFP为研究模型蛋白,不经过蛋白质的变性处理、直接通过向小鼠腹腔注射和皮肤涂抹这两种含TAT的融合蛋白及作为对照的融合蛋白GST-GFP,一定时间作用后取体内器官和皮肤做冷冻切片,荧光显微镜检测这些融合蛋白的跨膜递送情况;并对分别融合在C端或者N端的TAT介导GFP在活体动物体内和皮肤的跨膜递送作用进行对比。结果腹腔注射实验结果表明,TAT可以介导不经过蛋白质的变性处理的融合蛋白GST-TAT-GFP和GST-GFP-TAT跨膜递送进入到小鼠的心脏、肝、肾、脾和肺,甚至脑组织;其中GST-GFP-TAT跨膜递送效率比GST-TAT-GFP更高。结构模拟分析提示GST-GFP-TAT与GST-TAT-GFP中的TAT的暴露情况不同可能是造成两种蛋白跨膜递送活性差异的重要因素。皮肤实验的结果则表明TAT不仅介导融合蛋白GST-TAT-GFP和GST-GFP-TAT进入小鼠表皮,而且使其进入小鼠皮肤的真皮层。结论 TAT可以跨膜递送不经过变性处理的融合蛋白进入小鼠皮肤和体内,递送效率可能与TAT的暴露程度相关;这些结果为在蛋白质疗法方面应用TAT提供了进一步的理论依据。

TAT-β-半乳糖苷酶对小鼠生物膜穿透性的研究

为寻找介导外源蛋白质进入组织细胞的生物学方法 ,本研究构建了pET2 8a TAT LacZ重组表达子 ,纯化得到TAT β Gal融合蛋白 ,通过腹腔注射到小鼠体内观察TAT β Gal能否穿过各组织生物膜及达到各组织的时间、浓度。结果发现TAT β Gal在短时间内可到达各组织。该研究证明在生物大分子的N 末端加上TAT具有穿透力的蛋白转导区肽段形成的融合蛋白可穿过生物膜到达各组织 ,这一发现为肽类。

TAT-Cloan-DH-EGFP融合蛋白的原核表达及其在舞毒蛾幼虫体内的跨膜转导

【目的】为了探究滞育激素经昆虫取食的生物效应,需设计一种能够加速跨膜运输的融合蛋白,克服经昆虫消化道的降解作用。【方法】本研究以分月扇舟蛾Clostera anastomosis滞育激素基因Cloan-DH和TAT穿膜肽编码序列为基础,构建TAT-Cloan-DH融合基因;然后以增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)为标签,构建在p ET-22b载体中。在0.2 mmol/L IPTG诱导下,在大肠杆菌Escherichia coli BL21 Rosetta(DE3)中表达出TAT-CloanDH-EGFP融合蛋白。再分别将表达有TAT-Cloan-DH-EGFP和EGFP融合蛋白的大肠杆菌BL21菌体拌入人工饲料,经舞毒蛾Lymantria dispar幼虫持续取食0,8,24,48,72和90 h后,随机挑选试虫进行组织固定并制作石蜡切片,选取中肠所在体段切片进行组织荧光分析。【结果】37℃0.2 mmol/L IPTG诱导条件下,表达的TAT-Cloan-DH-EGFP融合蛋白的分子量为61 k D,主要以包涵体形式表达,融合蛋白约占细胞总蛋白含量的18.1%;随着试虫取食含TAT-Cloan-DHEGFP融合蛋白饲料的增加,虫体组织的绿色荧光强度逐渐增加,取食72 h后,组织荧光强度达到最高。【结论】实验结果说明融合蛋白TAT-Cloan-DH-EGFP可以通过消化道横向跨膜运输,到达虫体其他组织,且该过程与蛋白的摄入量成比例。

穿膜肽TAT-p38αG融合基因的构建、表达及穿膜特性的鉴定

目的构建穿膜肽TAT-p38αG融合基因,进行原核表达及穿膜特性鉴定。方法提取人EVC304细胞总RNA,巢式PCR扩增p38αG基因片段,T-A克隆,测序证实片段无误后,将p38αG基因片段亚克隆入原核表达载体pTAT-HA,获得pTAT-p38αG融合基因表达载体。将表达载体转化大肠杆菌,IPTG诱导表达获得TAT-p38αG融合蛋白,并行Ni-NTA柱过柱和超滤纯化,抗His抗体免疫印迹法鉴定。采用荧光素FITC体外标记TAT-p38αG融合蛋白,与EVC304细胞共培养,荧光显微镜下观察其穿膜特性。结果成功构建了融合基因原核表达载体pTAT-p38αG,并表达出大小约30×103的蛋白产物,与融合蛋白TAT-p38αG理论计算值相符。细胞实验结果显示,TAT-p38αG能呈浓度依赖性方式转导进入EVC304细胞。结论TAT-p38αG融合蛋白具有良好的穿膜特性,研究为下一步鉴定TAT-p38αG融合蛋白对p38α激酶的抑制作用奠定了良好的实验基础。

PSA启动子介导的TAT-p21^(WAF1/CIP1)融合蛋白在前列腺癌细胞中的特异表达及活性初探

目的:设计并构建含有前列腺组织特异性抗原(PSA)启动子的TAT-p21WAF1/CIP1融合蛋白真核表达载体(pPSA-TAT-p21),使由TAT蛋白转导结构域(TAT)介导的抑癌基因蛋白p21WAF1/CIP1(p21)能够在前列腺癌细胞中实现特异性的跨膜转运,增强p21对前列腺癌的抑制作用。方法:利用PCR技术构建含有PSA启动子、TAT蛋白转导序列和p21读码框架的真核表达载体pPSA-TAT-p21,并进行酶切、测序鉴定。脂质体法在前列腺癌LNCaP细胞和大肠癌HT-29细胞中转染上述表达载体及对照质粒后进行反转录PCR(RT-PCR),检测p21的mRNA以及蛋白在不同细胞中的表达情况。MTT法检测转染pPSA-TAT-p21后LNCaP细胞的增殖情况。结果:成功构建pPSA-TAT-p21真核表达载体。RT-PCR和Western blotting结果显示PSA-TAT-p21在前列腺癌细胞中有明显表达,在大肠癌细胞中基本不表达,呈现特异性的表达,而由CMV启动子介导的p21(pCMV-21)对照组在两个细胞株中均有表达。细胞增殖实验结果显示,含有TAT蛋白转导结构域的PSA-TAT-p21的融合蛋白对前列腺癌细胞增殖的抑制作用明显高于不含TAT的PSA-p21蛋白。结论:pPSA-TAT-p21能够在前列腺癌细胞中特异性地高效表达,为前列腺癌基因的靶向治疗提供了实验依据。

TAT融合蛋白在SD大鼠肾组织表达的研究

目的 :探讨分子量为 12 0kD的TAT融合蛋白在SD大鼠肾组织的吸收及酶活性的表达情况。方法 :利用“蛋白转导”的方法 ,将人类免疫缺陷病病毒HIV的TAT蛋白与 β -半乳糖苷酶 (β -Galactosidase,β -Gal)相连接 ,构建形成TAT - β -Gal融合蛋白 (分子量为 12 0kD)。将 72只SD大鼠随机分为 3组 (每组n =2 4 ) ,分别腹腔注射TAT - β -Gal、β -Gal和生理盐水 ,于注射后不同时间段取肾组织作病理切片 ,用X -Gal染色分析 ,显微镜下观察肾脏对TAT - β -Gal的吸收及酶活性的表达情况 ,并进行Leica计算机图像分析 ,同时观察肾组织结构改变。结果 :TAT - β -Gal组在经腹腔注射TAT - β -Gal 0 .5h后切片 ,用X -Gal染色 ,显微镜下即可显示着色反应 ,TAT - β -Gal可以快速到达肾组织 ,在肾小球细胞表达酶的活性 ,于 8h达到高峰 ,16h逐渐下降 ;β -Gal组经X -Gal染色后出现极弱的着色反应 ;而生理盐水组 ,经X -Gal染色后无着色反应。结论 :分子量为 12 0kD的TAT -β-Gal融合蛋白可以迅速被SD大鼠肾组织所吸收 ,同时不影响所连接蛋白酶的活性。HIV的TAT蛋白可以作为载体转运大分子 (蛋白或肽类大分子 )物质通过生物膜进入细胞内 。

TAT-hEGF融合蛋白在E.coli BL21(DE3)中高效自我表达

为了获得TAT-hEGF融合蛋白在E.coliBL21(DE3)中高效表达,构建了原核表达载体pRSET-tat-hegf,将其转化E.coliBL21(DE3)得到重组工程菌BL21(DE3)/pRSET-tat-hegf。工程菌在无IPTG的诱导下实现了高效表达,TAT-hEGF融合蛋白的表达量占总菌体蛋白的45.6%,主要以包涵体形式存在。

插入甘氨酸对HIV Tat-胸苷激酶融合蛋白生物学活性的影响

目的:探讨插入甘氨酸(G ly)对H IV Tat-TK融合蛋白功能的影响。方法:利用基因重叠(gene sp lic ing by overlap ex-tension,gene SOE ing)PCR技术,将不同长度的甘氨酸密码子(0、2、4、6个)插入H IV Tat-TK融合基因,经转染、鉴定证实后诱导表达,并经偶联Tat单克隆抗体的Sepharose CL-4B亲和层析柱纯化。4种H IV Tat-(G ly)n-TK系列融合蛋白(n=0、2、4、6)、H IV Tat蛋白、TK蛋白(1μg/m l)分别与HepG2细胞在普通培养基共培养24 h后,间接免疫荧光检测各自透过细胞膜效率;在加入更昔洛韦的培养基培养3 d后,锥虫蓝染色计算细胞死亡率,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:精确克隆出H IV Tat-(G ly)n-TK系列融合基因,成功表达H IV Tat-(G ly)n-TK系列融合蛋白以及H IV Tat和TK蛋白。H IV Tat-(G ly)n-TK系列融合蛋白与H IV Tat蛋白透过细胞膜的效率相似,但单独TK蛋白无法进入细胞;在含有更昔洛韦的培养基中H IV Tat-(G ly)4-TK融合蛋白致HepG2细胞凋亡率最高(14.77%),其余依次为H IV Tat-(G ly)2-TK融合蛋白(12.69%)、H IV Tat-TK(8.31%)、H IV Tat-(G ly)6-TK(4.36%)和H IV Tat组(1.03%),组间均有显著性差异(P<0.05);细胞死亡率也发现类似的结果(分别为80.2%、65.4%、58.4%、56.7%、9.1%,组间有显著差异,P<0.05)。结论:插入2、4、6个甘氨酸对H IV Tat-TK融合蛋白上游Tat蛋白的细胞融合穿透功能不产生影响,而对融合蛋白下游TK蛋白介导的更昔洛韦的细胞毒作用干扰较大,其中插入4个甘氨酸对TK蛋白介导的更昔洛韦的细胞毒作用影响最小。

TAT-ASPP2融合蛋白的制备及其对胶质瘤细胞增殖的抑制作用

目的:制备TAT-ASPP2融合蛋白,探讨其对人胶质瘤U-87MG细胞和U251细胞增殖的抑制作用。方法:设计TAT-ASPP2引物,应用IN-Fusion技术构建原核表达质粒pET-TAT-ASPP2,双酶切、DNA测序鉴定后转化大肠杆菌E.coliBL21,IPTG诱导TAT-ASPP2融合蛋白的表达,SDS-PAGE和Western blotting鉴定TAT-ASPP2融合蛋白。MTT法检测TAT-AS-PP2融合蛋白对U-87MG和U251细胞增殖的作用。结果:成功构建了原核表达质粒pET-TAT-ASPP2,转化E.coli BL21后成功表达TAT-ASPP2融合蛋白,其相对分子质量约为128000,并可被ASPP2特异性抗体所识别。TAT-ASPP2融合蛋白对U-87MG和U251细胞增殖的抑制率分别为(65.0±3.0)%和(64.7±2.5)%,而ASPP2蛋白则不能抑制U-87MG和U251细胞的增殖。结论:成功地克隆、表达及纯化TAT-ASPP2融合蛋白,该融合蛋白可抑制胶质瘤细胞的增殖。

TAT蛋白介导生物活性蛋白到达缺血灶的研究

目的 :以 β 半乳糖苷酶 (β Gal)为目的蛋白 ,观察TAT蛋白介导其到达缺血灶的情况、及有无血脑屏障 (BBB)的破坏。方法 :构建TAT β Gal融合基因表达质粒 ,转染大肠杆菌BL2 1(DE3)。利用鏊合金属亲合层析法纯化蛋白。将 36只SD大鼠随机分为 3组。其中 2组 ,采用经颈外动脉血管内直接线栓闭塞法 ,建立可复流的大脑中动脉闭塞(MCAO )模型 ,分别腹腔注射TAT β Gal 5mg·kg- 1,β Gal 5mg·kg- 1,并同时注射Evan’s蓝。另一组为假手术组 ,腹腔注射TAT β Gal 5mg·kg- 1。3组分别于给药后 30min ,2h ,4h断头取脑、快速冰冻切片 ,脑切片间隔行x Gal及TTC染色。结果 :MCAO模型SD大鼠 ,腹腔注射TAT β Gal融合蛋白后 ,30min时脑组织各个区域及缺血灶区即可检测到外源性 β Gal的活性 ,4h达高峰 ,同时BBB没有被破坏。而对照组 ,脑组织各个区域未检测到外源性β Gal的活性。结论 :TAT蛋白能有效地介导生物活性蛋白通过BBB进入缺血灶区在脑组织内达到有效浓度。