TAT蛋白转导域,Mx基质蛋白以及联合蛋白的研究

TAT蛋白转导域是源自人类免疫缺陷病毒(HIV)PTD蛋白的一段碱性氨基酸蛋白,HIV-Tat蛋白的转导域(PTD)具有穿膜活性,能够将与之共价连接的多肽、蛋白、核酸等生物大分子快速而高效地转导入细胞内部,并且对细胞没有毒副作用,在药物转运和疾病治疗等领域有着巨大的应用潜力。P14是一个致癌基因,具有广谱的抗病毒能力,对RNA病毒,如流感病毒、水泡性口炎病毒、托高土病毒、汉坦病毒和狂犬病毒等有作用,甚至对DNA病毒(如乙型肝炎病毒)也有一定的作用。TAT-p14联合基因具有明显的抗病毒作用,本文论述了TAT蛋白转导域与p14基因联接方法的构建。

p53-TAT融合蛋白的克隆表达及其对HepG 2细胞的促凋亡作用

目的研究连接TAT蛋白转导域的p53融合蛋白对人肝癌细胞株HepG 2的促凋亡作用。方法用反转录法从人正常肝细胞株L-02中获得野生型p53基因cDNA,构建原核表达质粒pET-27b/p53及pET-27b/p53-TAT。IPTG诱导表达重组蛋白,重组蛋白经N-i NTA柱纯化后,加入HepG 2细胞培养液上清,采用四唑氮盐比色法(MTT法)和单细胞凝胶电泳法检测p53及p53-TAT融合蛋白对HepG 2细胞生长的影响。结果成功构建质粒pET-27b/p53及pET-27b/p53-TAT,表达纯化了p53蛋白及p53-TAT蛋白。MTT法和单细胞凝胶电泳法结果表明,与p53蛋白相比,p53-TAT融合蛋白能更有效地抑制HepG 2细胞生长、促进凋亡。结论 p53-TAT融合蛋白能够有效促进HepG 2细胞凋亡。

融合肽TAT-Helicokinin I对舞毒蛾生物活性研究

以美洲棉铃虫Helicoverpa zea利尿激肽Helicokinin I和穿膜肽TAT为基础合成融合肽TAT-Helicokinin I,并测试3种肽对舞毒蛾Lymantria dispar幼虫的注射活性;探究融合肽TAT-Helicokinin I和利尿激肽Helicokinin I经取食途径进入虫体后对舞毒蛾幼虫生长的影响。结果表明:TAT-Helicokinin I和Helicokinin I对舞毒蛾幼虫均表现出注射毒性,且TAT-Helicokinin I比Helicokinin I表现出更高的生物活性;60,600 pmol/头的剂量对舞毒蛾幼虫均表现出显著致死性,6 pmol/头的剂量对舞毒蛾幼虫生长无影响;Helicokinin I饲喂舞毒蛾幼虫未显现出毒性,而饲喂TAT-Helicokinin I对试虫生长表现出显著抑制作用。该研究证实TAT与Helicokinin I融合后能够降低昆虫消化道酶对利尿激肽Helicokinin I的降解。

融合TAT重组猪细小病毒样粒子的构建及鉴定

为表达和鉴定含TAT蛋白转导域的重组猪细小病毒(PPV)样粒子,以PPV N株为模板扩增其VP2基因,将具有穿膜功能的TAT蛋白转导域连接在VP2基因的N端,构建TAT-VP2融合基因,并用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统构建含TAT-VP2基因的重组杆状病毒,感染昆虫细胞进行融合基因的表达,通过间接免疫荧光(IFA)、电镜观察及血凝试验对表达产物进行鉴定。IFA结果显示细胞表达产物能与鼠抗PPV抗体发生特异性反应,透射电镜观察到表达产物可装配形成典型的病毒样粒子结构,形态大小与野生型PPV及VP2病毒粒子相似;血凝试验证实融合TAT重组PPV-VLPs具有与全病毒相同的血凝活性。试验结果为进一步研制高效PPV亚单位疫苗奠定了基础。