TAT蛋白转导结构域介导融合蛋白在小鼠活体的跨膜递送作用

目的探讨跨膜递送短肽——TAT蛋白转导结构域(简称TAT)介导的与其融合的活性蛋白在活体的跨膜递送作用。方法以融合蛋白GST-TAT-GFP,GST-GFP-TAT和GST-GFP为研究模型蛋白,不经过蛋白质的变性处理、直接通过向小鼠腹腔注射和皮肤涂抹这两种含TAT的融合蛋白及作为对照的融合蛋白GST-GFP,一定时间作用后取体内器官和皮肤做冷冻切片,荧光显微镜检测这些融合蛋白的跨膜递送情况;并对分别融合在C端或者N端的TAT介导GFP在活体动物体内和皮肤的跨膜递送作用进行对比。结果腹腔注射实验结果表明,TAT可以介导不经过蛋白质的变性处理的融合蛋白GST-TAT-GFP和GST-GFP-TAT跨膜递送进入到小鼠的心脏、肝、肾、脾和肺,甚至脑组织;其中GST-GFP-TAT跨膜递送效率比GST-TAT-GFP更高。结构模拟分析提示GST-GFP-TAT与GST-TAT-GFP中的TAT的暴露情况不同可能是造成两种蛋白跨膜递送活性差异的重要因素。皮肤实验的结果则表明TAT不仅介导融合蛋白GST-TAT-GFP和GST-GFP-TAT进入小鼠表皮,而且使其进入小鼠皮肤的真皮层。结论 TAT可以跨膜递送不经过变性处理的融合蛋白进入小鼠皮肤和体内,递送效率可能与TAT的暴露程度相关;这些结果为在蛋白质疗法方面应用TAT提供了进一步的理论依据。

分泌型TAT蛋白转导结构域基因通用真核表达载体的构建及表达

目的:构建一个全新的分泌型TAT蛋白转导结构域基因哺乳动物细胞融合表达载体并对融合蛋白的表达进行分析。方法:依照编码TATPTD11肽及所引入的BamHI酶识别序列和增强性绿色荧光蛋白N端7个氨基酸的碱基序列合成了3条引物,以egfp基因为模板通过依次3轮PCR扩增得到tategfp融合基因,该基因片段以SfiI和HindⅢ双酶切后插入哺乳动物细胞表达载体pSectagA,构建成重组载体pSecTATmegfp,BamHI单酶切后该载体自连,即得到可通用的真核表达载体pSecTATm,重组质粒pSecTATmegfp转染HEK293细胞,融合蛋白的表达用Westernblot分析。结果:酶切及测序证实表达载体pSecTATm构建成功,Westernblot表明TATEGFP融合蛋白在HEK293细胞中获得表达并分泌到细胞培养液中。结论:成功地构建了分泌型TAT蛋白转导结构域基因的哺乳动物细胞融合表达载体,为更充分发挥TAT蛋白转导结构域在蛋白质功能及疾病治疗研究中的应用打下了基础。

TAT蛋白转导结构域介导的BCR/ABL融合蛋白在小鼠体内的跨膜转运

目的 探讨HIV 1反式激活蛋白 (TAT)的蛋白转导结构域 (PTD)介导的BCR ABL(TATPTD BCR ABL)融合蛋白在小鼠体内的跨膜转运和通过血脑屏障作用。方法 在大肠杆菌中表达PTD BCR ABL融合蛋白 ,经Ni NTA树脂亲合层析 ,纯化后的融合蛋白经小鼠尾静脉注射体内 ,用免疫组织化学方法对小鼠组织细胞内的PTD BCR ABL融合蛋白进行检测。结果 ①表达和纯化了分子量为 2 3× 10 3的PTD BCR ABL融合蛋白 ;②在接受融合蛋白的小鼠肝、脾、肾及心肌组织的细胞内检测到了PTD BCR ABL融合蛋白 ;③接受融合蛋白的小鼠脑组织细胞中可以检测到融合蛋白的存在。结论 PTD可在体内介导较大分子量的融合蛋白进入组织细胞和通过血脑屏障 。

Tat蛋白转导结构域介导HSV1-TK导入肝癌细胞及其效应

目的：探讨HIV-1编码的反式激活蛋白Tat与HSV1-TK融合表达对肝癌细胞的杀伤效果。方法：合成编码HIV-Tat47-57（Tat 11）的2条寡核苷酸单链，两端分别引入BamH Ⅰ和Hind Ⅲ两个酶切位点，退火形成寡核苷酸双链，15％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳判断退火效果；以r-pAs16Dr为模板，通过PCR扩增HSV1-TK基因，定向克隆至原核表达载体pET-32中。将含pET-32c-Tat 11-TK的BL21菌通过IPTG诱导表达，表达产物用Ni^（2＋）螯合柱亲和纯化，免疫组化分析重组蛋白Tat 11-TK的膜结合特性，蛋白印迹技术分析该融合蛋白的穿膜能力，检测和分析TK／GCV、Tat 11-TK／GCV对肝癌细胞株HepG2的杀伤作用。结果：表达产物SDS-PAGE在相对分子质量60700左右显示条带，符合Tat 11-TK与表达标签融合蛋白的理论值，并证明以包涵体的形式表达；通过Ni^（2＋）螯合柱亲和纯化获得的Tat 11-TK重组融合蛋白，经免疫组化证实能结合到肝癌细胞表面，蛋白印迹结果说明Tat 11-TK能有效穿过细胞膜进入HepG2细胞内，同时应用低浓度前药更昔洛韦（GCV，150 μmol／L）能有效抑制HepG2细胞生长。结论：Tat 11-TK在原核系统获得高效表达，具有较强的穿膜能力和前药酶活性。

一种基于HIV-1TAT蛋白质转导结构域细胞内转导系统的成功改建

目的探索本室构建的pET14b-His-TAT-Flag重组载体表达的融合蛋白在细胞中转导效率低的原因,建立高效的细胞内转导系统。方法通过PCR方法去除原有载体中的Flag序列,在改建正确的pET14b-His-TAT重组载体基础上插入EGFP编码序列,将经酶切、DNA测序鉴定正确的pET14b-His-TAT-EGFP质粒转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导表达、SDS-PAGE鉴定正确,再经蛋白透析、过滤处理。将His-TAT-EGFP融合蛋白加入ECV304细胞中,用荧光显微镜观察。结果重组质粒pET14b-His-TAT融合表达载体和pET14b-His-TAT-EGFP重组载体经酶切、DNA测序鉴定证实构建成功。表达纯化出了高纯度His-TAT-EGFP融合蛋白并具有较高细胞内转导活性。结论成功改建pET14b-His-TAT-Flag重组载体,正确构建pET14b-His-TAT-EGFP载体,His-TAT-EGFP融合蛋白高效表达,并具有明确的细胞内转导活性。

TAT蛋白转导结构域的研究进展

目前，应用基因重组技术人工合成治疗性蛋白质分子已经成为可能。但如何有效地将合成的蛋白质转运进入目标组织和细胞仍是当前需要解决的重大难题。蛋白转导结构域HIV-TAT的发现为体内外转运蛋白质进入细胞提供了新思路。近年来蛋白转导结构域转运蛋白质进入细胞的有效性以及其在疾病治疗中的价值已经得到不断证实。现主要对蛋白转导结构域HIV-TAT的研究进展作一综述。

TAT蛋白质转导结构域与SV40启动子特异的三锌指结构融合蛋白的表达与纯化

利用蛋白质转导结构域(PTDs)可以将与之融合表达的蛋白质直接送入细胞中。将通过筛选噬菌体展示锌指文库得到的特异作用于SV40启动子上9bp序列的三锌指结构的序列插入含有TAT蛋白的蛋白质转导结构域的表达载体pET-TAT-NLS中,构建融合蛋白的表达载体pET-TAT-NLS-clone3。融合蛋白在E.coliBL21(DE3)中得到了可溶性表达,含量约占总蛋白的18%;并通过镍亲和凝胶层析柱得到了较好的纯化融合蛋白。

带有蛋白转导结构域的Bcr/Abl癌蛋白片段的表达及其跨膜转运

HIV 1编码的反式激活蛋白TAT具有将细胞外蛋白转导进入细胞的基序 ,称为蛋白转导结构域 (PTD) .为研究PTD介导的PTD Bcr Abl融合蛋白的跨膜转运 ,合成了编码PTD的基因片段 ,并与PCR扩增的慢性粒细胞白血病癌蛋白bcr abl基因片段融合 .在大肠杆菌中表达纯化了融合蛋白 ,将纯化的融合蛋白加入培养的HL60细胞和C2C12细胞后 ,发现PTD基序可以介导Bcr Abl蛋白自由从细胞外跨膜转导进入细胞内 .研究结果可能为用外源蛋白负载 (loading)免疫活性细胞如抗原提呈细胞提供新的途径 .

反式激活蛋白转导结构域介导绿色荧光蛋白在小鼠体内的跨膜转运

目的探讨HIV-1反式激活蛋白(TAT)的蛋白转导结构域(PTD)介导绿色荧光蛋白(EGFP)在小鼠体内的跨膜转运作用。方法采用PCR及克隆技术构成表达载体pET28a-TAT-EGFP,在大肠杆菌中表达TAT-EGFP融合蛋白,将纯化后的融合蛋白注入小鼠尾静脉,取脑、心肌、肝、脾和肾等器官冰冻切片,荧光显微镜下观察融合蛋白在组织中的分布。结果表达和纯化了分子量为28KD的TAT-EGFP融合蛋白,在小鼠的肝、心肌、脑、肾和脾等组织切片荧光检测呈阳性。结论TAT可介导EGFP在广泛组织内的跨膜转导,这一研究为外源活性大分子物质进入组织细胞提供了一个新的途径。

蛋白质转导结构域的跨血脑屏障药物递送

药物递送入脑的主要障碍是血脑屏障,为克服血脑屏障,目前主要采取神经外科手术、增加分子脂溶性、通过内源性血脑屏障转运载体的递送策略。PTD介导跨血脑屏障药物递送是近来出现的新技术,可以方便、高效地使各种分子通过外周血、腹腔等途径,跨越血脑屏障进入脊髓、脑组织细胞。PTD递送快捷、简单、安全,为中枢神经系统疾病的治疗提供了新的研究思路。

TAT-Smad7-HA融合蛋白的表达及其转导活性验证

目的构建、表达、纯化、鉴定并标记TAT-Smad7-HA融合蛋白,验证其在体外培养的人原代瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblast cell,KFB)中的转导活性。方法分别将TAT-PTD、Smad7基因和HA片段依次连接入pET32a(+)质粒构建成pTAT-Smad7-HA重组原核表达载体,IPTG诱导表达后经亲和纯化、Western blot验证、肠激酶切割、目的片段回收和FITC标记后,将FITC-TAT-Smad7-HA融合蛋白作用于体外培养的人原代KFB以观察其转导活性。结果成功构建了TAT-Smad7-HA融合蛋白的原核表达载体pTAT-Smad7-HA,目的蛋白在诱导后获得了高效表达(占菌体总蛋白的25%以上),并成功进行了纯化(纯度达95%以上)、脱盐柱脱盐、Western blot验证、硫氧环蛋白切除及FITC标记,得到相对分子质量约为50×103的FITC-TAT-Smad7-HA融合蛋白,并进一步在体外培养的人KFB细胞中证实了其高转导活性。结论本实验获得了高纯度的FITC-TAT-Smad7-HA融合蛋白,并验证了其在KFB中的高转导活性。

利用蛋白质转导结构域进行生物大分子的胞内转运

由于细胞膜的存在限制了生物利用度,大分子物质的胞内转运还存在许多问题。最近通过对蛋白质转导结构域的研究已经排除了这一障碍。应用蛋白质转导结构域将大分子蛋白质、核酸、病毒、小分子物质转运到目标细胞内已引起了人们越来越多的关注。虽然十年前就发现了蛋白质转导结构域,如触足蛋白、Tat及Vp22,但其作用机制刚刚明确并开始被广泛的应用。除了富含精氨酸的蛋白质转导结构域,我们通过流式细胞光密度的测定和酶的测定,还发现赖氨酸同聚物也能够介导许多细胞的转导过程。蛋白质转导结构域,有天然存在的和人工合成的,已越来越广泛的应用于将生物活性物质转运到细胞内以便更好的治疗某些疾病,如癌症、中风、关节炎等等。

蛋白转导结构域4-铜/锌-超氧化物歧化酶融合蛋白的制备及其穿细胞膜的功能研究

目的拟构建蛋白转导结构域(PTD)4-铜/锌-超氧化物歧化酶(Cu/ZnSOD)原核表达质粒,纯化制备PTD4-Cu/ZnSOD融合蛋白,探讨其穿膜能力。方法设计合成hCu/ZnSOD引物,扩增hCu/ZnSOD cDNA片段;采用PCR靶向克隆法将扩增产物与含有相同酶切位点载体质粒PET16b-PTD4进行重组,扩增质粒,双酶切鉴定和DNA测序;获得PET16b-PTD4-Cu/ZnSOD(CDs)原核表达载体,导入感受态E.coli BL21(DE3)中,进行扩增培养,收集菌体,将其裂解离心、Ni_2^+亲和层析、收集目的蛋白。融合蛋白孵育人心肌细胞,免疫荧光法检测融合蛋白穿膜能力。结果通过测序证实实验扩增所得的PTD序列与设计的预期序列一致。设计并简并PTD4-Cu/ZnSOD基因长度为567 bp,通过引物进行正反向测序证实该序列与已被登录的GENBANK中Cu/ZnSOD序列相一致,并构建了相应的原核表达质粒。并在E.coli BL21进行大量表达,最终收集的PTD4-Cu/ZnSOD具有良好水溶性。SDS-page分析显示构建的PTD4-Cu/ZnSOD分子量约为20 kDa,与预期的蛋白分子量20.45 kDa相符合。融合蛋白可以穿透心肌细胞胞膜,进入细胞后主要分布在胞质和胞核内并具有天然活性。结论成功地构建了PET16bPTD4-Cu/ZnSOD原核表达质粒,获得了可穿透心肌细胞膜的PTD4-Cu/ZnSOD融合蛋白,为应用Cu/ZnSOD治疗缺血性疾病的研究奠定了基础。

带Tat标记质粒载体的构建及其转导融合蛋白进入细胞的研究

采用点突变技术构建了带 6×His、Tat和Flag多个标记的pET HTF的质粒载体 ,利用基因重组技术构建pET HTF EGFP融合蛋白载体 .酶切和DNA测序证明 ,所构建的pET HTF和pET HTF EGFP载体正确 .BL2 1(DE3)表达融合蛋白 ,用Ni2 + 分离柱纯化His Tat Flag EGFP蛋白 ,并加入培养的NIH3T3细胞 .荧光显微镜观察显示 ,His Tat Flag EGFP融合蛋白进入细胞 .带His、Tat和Flag标记的质粒载体pET 14b HTF表达的融合蛋白能够进入细胞 。

TAT-EGFP融合蛋白的表达及在PC12细胞的转导活性

目的构建pET28a-TAT-EGFP重组子,观察表达的融合蛋白TAT-EGFP在细胞内的转导活性.方法人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a后再连接EGFP基因,组成pET28a-TAT-EGFP重组表达子.转化大肠杆菌,IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达,组氨酸亲和层析柱纯化.将融合蛋白加入培养的PC12细胞,观察荧光进入细胞的情况.结果成功地构建了高表达pET28a-TAT-EGFP重组子,纯化了分子质量约为29ku的融合蛋白TAT-EGFP,并在体外培养的PC12细胞中证实TAT-EGFP融合蛋白穿透生物膜的能力.结论通过对TAT-EGFP融合蛋白的表达纯化及活性分析,证实了TAT的蛋白转导作用,为肽类及生物大分子药物进入组织细胞内发挥治疗作用提供了理论基础.

Tat-p53融合蛋白的表达、纯化及其转导活性

目的:原核表达野生型p53与TatPTD(proteintransductiondomain)的融合蛋白,检测TatPTD介导p53进入肝细胞的效率。方法:利用RT-PCR方法从A549细胞系中分离野生型p53基因,将该基因分别克隆入pTAT-HA和pET-32a原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)LysS内诱导表达并进行纯化。以纯化的p53蛋白经腹腔免疫BALB/c小鼠,制备高效价的抗血清。将Tat-p53融合蛋白加入HepG2细胞培养上清,利用间接免疫荧光法检测Tat-p53融合蛋白导入HepG2细胞的效率。结果:成功地构建了含有野生型p53基因的原核表达载体,表达纯化了Tat-p53融合蛋白及p53蛋白,制备p53特异的抗血清,证实Tat-p53可以高效的转入HepG2细胞内。结论:Tat-p53融合蛋白的表达纯化及活性分析,为应用Tat-p53融合蛋白治疗肝癌的实验研究奠定了基础。

His-TAT-mCherry融合蛋白的跨膜转导及其在细胞内的定位

目的构建在原核中表达的人类免疫缺陷病毒转录活化因子(HIV-TAT)红色荧光蛋白(mCherry)融合表达载体,荧光显微镜观察HIV-TAT的跨膜转导及其在细胞内的定位,为进一步研究HIV-TAT的跨膜转导机制及其定位提供重要工具。方法采用基因重组技术构建含HIV-TAT以及红色荧光蛋白的质粒pET14b-His-TAT-mCherry,对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,将该质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞,使其在体外表达,并进行纯化、除菌。将纯化的His-TAT-mCherry融合蛋白与Hela细胞共同孵育,荧光显微镜下观察。结果PCR、双酶切和DNA测序证明所构建质粒正确;表达纯化出了高纯度的His-TAT-mCher-ry融合蛋白。荧光显微镜下见Hela细胞中红色荧光蛋白主要分布在胞质中,细胞膜上也有一定分布。结论成功构建了pET14b-His-TAT-mCherry原核表达质粒,纯化了高纯度的His-TAT-mCherry融合蛋白,该蛋白在哺乳动物细胞中有跨膜转导活性,为研究HIV-TAT的跨膜转导机制提供了一个重要的工具。

TAT-Cloan-DH-EGFP融合蛋白的原核表达及其在舞毒蛾幼虫体内的跨膜转导

【目的】为了探究滞育激素经昆虫取食的生物效应,需设计一种能够加速跨膜运输的融合蛋白,克服经昆虫消化道的降解作用。【方法】本研究以分月扇舟蛾Clostera anastomosis滞育激素基因Cloan-DH和TAT穿膜肽编码序列为基础,构建TAT-Cloan-DH融合基因;然后以增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)为标签,构建在p ET-22b载体中。在0.2 mmol/L IPTG诱导下,在大肠杆菌Escherichia coli BL21 Rosetta(DE3)中表达出TAT-CloanDH-EGFP融合蛋白。再分别将表达有TAT-Cloan-DH-EGFP和EGFP融合蛋白的大肠杆菌BL21菌体拌入人工饲料,经舞毒蛾Lymantria dispar幼虫持续取食0,8,24,48,72和90 h后,随机挑选试虫进行组织固定并制作石蜡切片,选取中肠所在体段切片进行组织荧光分析。【结果】37℃0.2 mmol/L IPTG诱导条件下,表达的TAT-Cloan-DH-EGFP融合蛋白的分子量为61 k D,主要以包涵体形式表达,融合蛋白约占细胞总蛋白含量的18.1%;随着试虫取食含TAT-Cloan-DHEGFP融合蛋白饲料的增加,虫体组织的绿色荧光强度逐渐增加,取食72 h后,组织荧光强度达到最高。【结论】实验结果说明融合蛋白TAT-Cloan-DH-EGFP可以通过消化道横向跨膜运输,到达虫体其他组织,且该过程与蛋白的摄入量成比例。

Toll样受体与核苷酸结合寡聚化结构域蛋白在防御反应中的相互作用

哺乳动物具有两个微生物识别系统,一个系统是由Toll样受体(TLRs)的膜结合受体家族组成;另一个系统是由位于胞浆的核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)蛋白家族组成。入侵机体的微生物可能通过不同抗原激活多个模式识别受体,导致免疫反应的产生。本文将对TLRs及NODs信号通路在防御反应中的相互作用进行综述。

快速构建蛋白质结构域克隆库的方法

对蛋白质组学的研究有许多不同的切入方法 .从研究的生物学意义和可行性考虑 ,提出从蛋白结构域入手进行蛋白质组学研究 .SH2 (Srchomology 2 )结构域是细胞信号转导中重要的元件之一 ,人SH2结构域共有约 12 0种 ,对其进行研究将深刻揭示细胞信号转导的规律 .为了得到人所有的SH2结构域序列及克隆 ,首先在公共数据库里检索出了人所有的SH2结构域序列 ,利用国际上现有的共享资源IMAGE(IntegratedMolecularAnalysisofGenomesandTheirExpression)克隆为PCR模板 ,解决了从cDNA文库中难以克隆低丰度结构域的问题 .利用有方向性的TOPO克隆技术提高克隆效率 ,从而快速高效地构建了包括 6 0个SH2结构域的克隆库 .克隆库可以方便地转换到GATEWAY系统具有各种用途的载体上 。