Tat-p53融合蛋白的表达、纯化及其转导活性

目的:原核表达野生型p53与TatPTD(proteintransductiondomain)的融合蛋白,检测TatPTD介导p53进入肝细胞的效率。方法:利用RT-PCR方法从A549细胞系中分离野生型p53基因,将该基因分别克隆入pTAT-HA和pET-32a原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)LysS内诱导表达并进行纯化。以纯化的p53蛋白经腹腔免疫BALB/c小鼠,制备高效价的抗血清。将Tat-p53融合蛋白加入HepG2细胞培养上清,利用间接免疫荧光法检测Tat-p53融合蛋白导入HepG2细胞的效率。结果:成功地构建了含有野生型p53基因的原核表达载体,表达纯化了Tat-p53融合蛋白及p53蛋白,制备p53特异的抗血清,证实Tat-p53可以高效的转入HepG2细胞内。结论:Tat-p53融合蛋白的表达纯化及活性分析,为应用Tat-p53融合蛋白治疗肝癌的实验研究奠定了基础。

Tat-p53融合蛋白的表达、纯化及其转导活性

目的：原核表达野生型p53与Tat PTD（protein transduction domain）的融合蛋白，检测TatPTD介导p53进入肝细胞的效率。方法：利用RT-PCR方法从A549细胞系中分离野生型p53基因，将该基因分别克隆入pTAT-HA和pET-32a原核表达载体，在大肠杆菌BL21（DE3）LysS内诱导表达并进行纯化，以纯化的p53蛋白经腹腔免疫BALB/c小鼠，制备高效价的抗血清，将Tat-p53融合蛋白加入HepG2细胞培养上清，利用间接免疫荧光法检测Tat-p53融合蛋白导入HepG2细胞的效率。结果：成功地构建了含有野生型p53基因的原核表达载体，表达纯化了Tat-p53融合蛋白及p53蛋白，制备p53特异的抗血清，证实Tat-p53可以高效的转入HepG2细胞内。结论：Tat-p53融合蛋白的表达纯化及活性分析，为应用Tat-p53融合蛋白治疗肝癌的实验研究奠定了基础。

PTD-p53融合蛋白的表达、纯化及其对肝癌细胞的转导活性

目的:原核表达野生型p53与PTD的融合蛋白,检测PTD介导p53进入肝癌细胞的效率。方法:利用RT-PCR方法从A549细胞系中分离野生型p53基因,将该基因分别克隆入pTATHA和pET32 a原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)LysS内诱导表达并进行纯化。以纯化的p53蛋白经腹腔免疫BALB/c小鼠,制备高效价的抗血清。将PTD-p53融合蛋白加入HepG2细胞培养上清,利用间接免疫荧光法检测PTD-p53融合蛋白导入HepG2细胞的效率。结果:成功地构建了含有野生型p53基因的原核表达载体,表达纯化了p53融合蛋白及p53蛋白,证实PTD-p53可以高效地转入HepG2细胞。结论:PTD-p53融合蛋白的表达纯化及活性分析,为应用PTD-p53蛋白治疗肝癌的实验研究奠定了理论基础。

P^(53)融合蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

目的为研制出能特异与Ｐ５３结合的单克隆抗体，使对Ｐ５３的检测得到更为广泛的应用。方法用ＰＣＲ技术扩增编码人Ｐ５３Ｎ－端１８０个氨基酸的ＤＮＡ片段并将其克隆在谷胱苷肽转移酶（ＧＳＴ）表达质粒ＰＧＥＸ－２Ｔ中。用该重组质粒转化大肠杆菌ＪＭ１０９，并经异丙基β－Ｄ硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导产生Ｐ５３－ＧＳＴ融合蛋白。用Ｐ５３－ＧＳＴ免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠。常规细胞融合，间接酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）双筛和免疫组织化学（ＩＨＣ）筛选。结果获得一株能稳定分泌抗Ｐ５３单抗的杂交瘤细胞株，其分泌的单抗（命名为Ｍ１２６），亚类为ＩｇＧ２ｂ。用单抗Ｍ１２６与常用Ｐ５３进口单抗ＰＡＢ１８０１（ＺＹＭＥＤ公司）同时对５２例乳腺癌的石蜡切片标本进行ＩＨＣ分析，阳性检测率分别为４８．１％（２５／５２）和４２．３（２２／５２），与ＰＡＢ１８０１相比Ｍ１２６表现出更强的反应特异性，在一定程度上优于ＰＡＢ１８０１。结论Ｍ１２６可替代进口单抗ＰＡＢ１８０１用于Ｐ５３免疫组织化学研究。

抗人γ-精浆蛋白V_H单域抗体/人p53四价功能域融合基因的构建及空间构象分析

目的 构建抗人γ 精浆蛋白 (γ Sm)重链可变区 (VH)单域抗体 /人 p5 3四价功能域融合基因 ,并进行空间构象分析。方法 选用人IgG3上游铰链区作为抗体和人p5 3四价功能域之间连接的linker。利用回归PCR法扩增人IgG3上游铰链区与人p5 3四价功能域融合基因 ,并在融合基因 5’端和 3’端引入SalⅠ与HindⅢ酶切位点 ,将融合基因克隆入 pUC1 9载体中构建pUC1 9/IgG3 /p5 3克隆载体。将抗人γ SmVH 单域抗体克隆入 pUC1 9/IgG3 /p5 3载体中 ,构建抗人γ SmVH 单域抗体 /人 p5 3四价功能域融合基因。经酶切鉴定及序列测定证实后 ,利用计算机软件进行空间构象分析。结果 获得了抗人γ SmVH 单域抗体 /人 p5 3四价功能域融合基因 ,基因全长 5 2 8bp ,可编码 1 76个氨基酸 ,与已发表的抗人γ SmVH 单域抗体、人IgG3上游铰链区和人p5 3四价功能域基因cDNA序列一致。计算机软件分析结果显示 ,融合基因表达产物可自动装配成四聚体抗体 ,并具有四条长的、柔性好的多肽 ,可确保每个抗体空间构象的独立性。结论 构建成功四价抗人γ SmVH 单域抗体 ,为进一步临床应用奠定基础。

重组人P53融合蛋白抗肝癌细胞的实验研究

研究蛋白传导域(PTD)与人野生型P53(W tP53)融合表达的P53融合蛋白PTD-P53对HepG2的增殖抑制和凋亡的影响。用PTD-P53处理HepG2后,采用MTT法分析处理后细胞的生长增殖情况,流式细胞术(FCM)分析处理后细胞周期变化及脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡情况。PTD-P53对HepG2的生长有明显抑制作用。细胞周期也出现阻滞现象,细胞凋亡明显增加。PTD-P53有一定的抗肝癌细胞作用。

TAT融合蛋白转导红内期恶性疟原虫

目的:探讨TAT-p53融合蛋白转导进入红内期恶性疟原虫的特性.方法:将纯化的TAT-p53融合蛋白和p53蛋白分别与培养疟原虫共孵育30min后,制备血涂片,利用间接免疫荧光方法检测融合蛋白的转导.同时计算融合蛋白与疟原虫共孵育12h前后的感染率变化,观察蛋白转导对疟原虫生长的影响.结果:TAT-p53融合蛋白可以突破红内期疟原虫各层细胞膜,进入虫体细胞内,并可根据荧光观察到融合蛋白主要分布在疟原虫滋养体和晚期裂殖体,而p53蛋白不能进入疟原虫内.融合蛋白与疟原虫共孵育12h后其感染率与对照组之间无显著差异(P>0.05),说明蛋白转导对疟原虫的生长没有影响.结论:TAT融合蛋白可以转导进入疟原虫内,这将为疟原虫相关基因功能的研究提供一种新方法.

重组人野生型P53融合蛋白的克隆表达和对肿瘤细胞的作用

目的通过基因重组改善P53蛋白的功能，并研究它对肿瘤细胞的作用。方法构建人野生型P53(wtP53)融合蛋白的原核细胞表达载体PGEX-3X—PTD—P53，诱导表达和亲和层析纯化后，采用MTT法和流式细胞仪检测它对肿瘤细胞的增殖抑制作用和促细胞凋亡。结果成功构建P53融合蛋白的原核细胞表达载体PGEX-3X—PTD—P53，通过诱导表达和纯化获得重组人wtP53融合蛋白。MTT法和细胞流式分析证明该蛋白对几种癌细胞有明显的增殖抑制作用和促细胞凋亡。结论这种原核细胞表达的重组人wtP53融合蛋白保留了wtP53蛋白的生物学性状。

重组人野生型P53融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达与纯化

目的研究wtP53蛋白对肿瘤的治疗效果，提供药用wtP53融合蛋白。方法在本室构建的人野生型P53融合蛋白的原核细胞表达载体PGEX-3X-P53的基础上，IPTG诱导大肠杆菌表达wtP53融合蛋白，通过亲和层析柱纯化和因子Xa处理，SDS-PAGE分离。结果通过IPTG诱导后，在大肠杆菌中获得人野生型P53融合蛋白的高效表达，经过亲和层析纯化和Western印迹实验，表明获得重组人野生型P53融合蛋白。结论原核细胞表达的人wtP53融合蛋白具有天然P53蛋白的抗原性，可用于P53蛋白的体内外活性鉴定，以进一步应用于临床。

p53蛋白的原核表达及其鸡卵黄抗体的制备

目的制备抗p53蛋白卵黄抗体。方法原核表达p53融合蛋白,纯化后免疫产蛋母鸡。结果融合蛋白能有效刺激母鸡产生抗体,末次免疫后其卵黄抗体滴度达到1∶106,并且能维持较长时间。结论本文介绍的方法是一种简便、经济、特异、高效、均一、来源充足的抗体产生方法。

STX6和p53在食管癌组织中的表达及相互关系的研究

目的探讨突触融合蛋白6(syntaxin 6,STX6)和p53蛋白在食管癌组织中的表达及临床意义。方法应用免疫组织化学方法检测46例食管癌患者的肿瘤组织和癌旁食管组织中STX6和p53蛋白的表达情况,并进行统计分析。结果食管癌组织中STX6和p53蛋白的表达较癌旁食管组织明显上调,阳性率分别为54.3%和63.0%;相关分析发现STX6和p53蛋白的表达量与患者的性别、年龄无显著相关(P>0.05),但与肿瘤的分化程度以及淋巴结转移显著相关(P<0.05);STX6和p53在食管癌组织中的表达呈显著正相关(r=0.45,P<0.05)。结论 STX6作为p53家族的共同作用靶点,在食管癌发生、发展的过程中与p53起到了协同作用。

GST-hDaxx蛋白的构建及其原核表达产物的鉴定

目的 构建GST hDaxx蛋白并在原核细胞中诱导表达GST hDaxx融合蛋白 ,并研究其与 p5 3的结合能力。方法 构建GST hDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX 4T/hDaxx ,在大肠杆菌 (E .col i)中用异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达。表达产物用亲和层析柱加以纯化后 ,Westernblot鉴定表达产物与纯化物。通过共免疫沉淀反应与Westernblot观察hDaxx与p5 3的结合反应。结果 在原核细胞中成功表达了GST hDaxx融合蛋白 ,hDaxx与 p5 3可发生共免疫沉淀反应。 结论 1.GST hDaxx融合蛋白成功表达 ;2 .hDaxx和 p5 3的相互结合提示它们可能与肿瘤的发生有关。

肝癌bcl-2基因异常及与p53蛋白表达的关系

为探讨 bcl-2和 p53基因与肝细胞癌的关系,采用半套式原位聚合酶链反应和免疫组化技术原位检测40例肝细胞癌中 bcl-2/JH 融合基因、bcl-2蛋白及突变型 p53蛋白的表达。结果显示40例肝细胞癌中6例 bcl-2蛋白阳性,发生 bcl-2基因重排10例,25例 p53蛋白阳性.bcl-2蛋白表达与 bcl-2/JH 融合基因间无相互相对应关系。p53蛋白与 bcl-2蛋白表达及 bcl-2基因重排间无明显关系。结果说明,bcl-2和 p53基因均与肝细胞癌的发生有一定关系。bcl-2/JH 融合基因不是引起 bcl-2蛋白表达的唯一原因。bcl-2和 p53基因在肝细胞癌变过程中无协同作用。

端粒重复因子2与p53的体外结合

目的通过分析端粒主要结合蛋白端粒重复因子2 (TRF2)与p53的体外结合,探讨p53通过端粒途径调节细胞增殖、衰老和凋亡的分子机制.方法 4种不同的p53-谷胱甘肽S转移酶(glutathione S-transferase,GST)融合蛋白和GST经大肠杆菌表达、谷胱甘肽-SepharoseTM4B纯化,其中的人重组p53包括野生型(1～393)、C端缺失体p53 N5(2～293)、N端缺失体p53 N5(95～393)、第175位氨基酸突变体(R→H).将各纯化蛋白和人乳腺癌细胞MCF-7的细胞蛋白进行体外结合反应(pull down),Western blot 检测反应物中p53和TRF2的结合.结果纯化的GST和p53-GST融合蛋白纯度均在90%以上,且相对分子质量与预计的完全一致.TRF2的Western blot显示:野生型p53和p53-R175H均能沉淀MCF-7中的TRF2,且结合力相似,而单独的GST则无沉淀TRF2的作用.与野生型p53和p53 R175H相比,p53 2C与TRF2的结合力相对增加,p53 N5与TRF2的结合力相对大大减弱.结论 p53和TRF2可以进行直接而特异的体外结合,且其结合部位在p53 的C端(293～393). p53和TRF2 的C端依赖性结合可能与端粒动态变化所诱导的细胞活动有关.

体内蛋白传导及其在生物学上的应用前景

蛋白传导域 PTDs是在蛋白传导过程中能高效穿过生物膜的结构域。其可以使所有细胞作为传导对象 ,而且具有相当高的传导效率 ,但其传导的机制尚不明了。目前所发现的高效的 PTDs有 Tat,VP2 2 ,ANTP。当它们形成嵌合蛋白 ,或与蛋白质、多肽、DNA等分子化学相连 ,用于化合物的体内传导时 ,无论对于生物学上的理论问题还是基因治疗中的实际应用都有重大的意义。

亚砷酸钠及其代谢产物诱导16HBE细胞BCL2L2-PABPN1表达及机制探讨

目的探讨亚砷酸钠及其甲基化代谢产物诱导16HBE细胞融合基因B淋巴细胞瘤-2样蛋白2(BCL2L2)-多聚(A)结合蛋白核1(PABPN1)表达的差异及相关机制。方法(1)分别以浓度为1.5、3.0、4.5μmol/L的亚砷酸钠染毒16HBE细胞(设为低、中、高剂量砷染毒组),以浓度为4.5μmol/L一甲基胂酸(MMA)、二甲基胂酸(DMA)和亚砷酸钠染毒16HBE细胞(设为MMA组、DMA组和亚砷酸钠组),并设无毒物刺激的对照组。培养48 h后,以实时荧光定量聚合酶链式反应法(qRT-PCR)检测BCL2L2-PABPN1的表达。(2)设计两种小干扰RNA(siRNA)沉默片段转染16HBE细胞,以敲减BCL2L2-PABPN1,分别设为siRNA-1组和siRNA-2组;另设无敲减BCL2L2-PABPN1转染的对照组。培养48 h后,以qRT-PCR检测3组细胞中BCL2L2-PABPN1的表达,分别以MTS法、JC-1线粒体膜电位检测法检测细胞存活率和早期凋亡率,以Hoechest33342/碘化丙啶(PI)双重染色法观察细胞凋亡情况,以蛋白质免疫印迹法检测P53信号通路相关蛋白表达。结果(1)随着亚砷酸钠染毒剂量的增加,16HBE细胞BCL2L2-PABPN1相对表达水平增加(P<0.01);高剂量砷染毒组16HBE细胞BCL2L2-PABPN1相对表达水平分别高于对照组、低剂量砷染毒组和中剂量砷染毒组(P值均<0.05)。亚砷酸钠组16HBE细胞BCL2L2-PABPN1相对表达水平分别高于对照组、MMA组和DMA组(P值均<0.05);但对照组、MMA组和DMA组16HBE细胞BCL2L2-PABPN1相对表达水平两两比较,差异均无统计学意义(P值均>0.05)。(2)siRNA-1组、siRNA-2组16HBE细胞中BCL2L2-PABPN1相对表达水平和细胞存活率均低于对照组(P值均<0.05);但3组16HBE细胞早期凋亡率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。Hoechest33342/PI双重染色结果显示,siRNA-1组、siRNA-2组16HBE细胞核固缩和早期凋亡细胞的数量均较对照组增多。siRNA-1组、siRNA-2组16HBE细胞中P53、Ser392位点磷酸化P53、B淋巴细胞瘤-2相关死亡启动子、P21和细胞色素C的蛋白相对表达水平均高于对照组(P值均<0.05),P53上调凋亡因子蛋白相对表达水平均低于对照组(P值均<0.05)。结论亚砷酸钠可能通过诱导融合基因BCL2L2-PABPN1的表达,阻滞16HBE细胞凋亡;其机制与激活P53信号通路有关。亚砷酸钠甲基化代谢产物MMD和DMA对BCL2L2-PABPN1的表达无影响。BCL2L2-PABPN1可能通过BCL2L2和PABPN1基因的协同作用发挥抗凋亡效应。