日本鳗鲡TBK-1基因的克隆及免疫刺激的表达模式

利用PCR技术克隆了日本鳗鲡(Anguilla japonica)TBK-1基因(AjTBK-1),其开放阅读框为2193 bp,编码731个氨基酸。序列结构分析结果显示,AjTBK-1含有4个保守结构域,分别为氨基端激酶结构域,泛素样结构域和羧基端两个卷曲-螺旋结构域。系统发育分析表明,鱼类与四足类的TBK-1各自聚为一枝。实时定量PCR(qPCR)结果显示,AjTBK-1在日本鳗鲡各组织中均有表达。Poly I:C刺激6 h后,日本鳗鲡脾脏组织中AjTBK-1的上调倍数最高,为对照组的1.63倍;迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)感染24 h后,日本鳗鲡肝脏组织中AjTBK-1的上调倍数最高,为对照组的2.2倍:表明AjTBK-1参与了日本鳗鲡抗病毒、抗细菌免疫反应应答。

过表达SOX2对BCG诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞中TLR4/TBK-1/IRF3信号炎性反应的影响

目的探讨SOX2对肺泡Ⅱ型上皮细胞感染结核分枝杆菌后炎性反应的调控作用。方法利用过表达SOX2慢病毒感染肺泡上皮A549细胞系,嘌呤霉素筛选建立稳定过表达SOX2的A549细胞,利用RT-PCR和Western blot方法检测过表达SOX2细胞系的功能,Western blot和ELISA方法检测SOX2在肺泡Ⅱ型上皮细胞感染结核分枝杆菌后炎性相关蛋白及炎性因子的表达。结果成功构建过表达SOX2稳转细胞系,细胞中SOX2基因和蛋白均高表达(P<0.01)。用Western blot检测TLR4信号通路相关蛋白表达情况,过表达SOX2组与对照组(NC)相比较,TLR4、TRAF3、TBK-1和IRF-3蛋白表达均上调且差异极显著(P<0.01)。BCG刺激下,TLR4/TBK-1/IRF3相关蛋白均高表达,过表达SOX2减弱了BCG诱导的TLR4/TBK-1/IRF3相关蛋白的高表达,炎症因子IL-6和TNF-α亦表现出相同趋势。结论过表达SOX2能够减弱BCG诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞炎症反应。

流感病毒非结构蛋白对TBK-1的抑制作用

目的 流感病毒非结构蛋白1(nonstructuralprotein 1,NS1)抑制干扰素调节因子(inter feronregulatoryfactors,IRF) 3的机制未明,TANK结合激酶1(TANK bindingkinase 1,TBK- 1)能使IRF 3活化,研究NS1是否对TBK -1有抑制作用。方法 亚克隆IRF 3、NS1和TBK- 1至pcDNA3.1 flag构建flag IRF 3、flag NS1和flag TBK- 1质粒;用TBK- 1对TBK- 1+NS1以及IRF 3+TBK- 1对IRF 3+TBK- 1+NS1两组实验,分别共转染人胚胎肾上皮2 93细胞,用抗flag抗体作Westernblot分析,鉴定IRF 3、NS1和TBK- 1的表达,观测NS1对TBK 1活化IRF 3的抑制作用;荧光素酶功能分析方法观测NS1对TBK 1诱导的干扰素β(IFN β)启动子pGL- 2B荧光素酶活性的影响。结果 IRF- 3、NS1和TBK- 1均有高表达。TBK 1能使IRF 3活化,Westernblot分析显示:TBK -1转染的细胞出现迁移较慢的IRF 3Ⅲ和Ⅳ型,NS1共转染可使IRF- 3Ⅲ和Ⅳ型几乎消失;荧光素酶功能分析显示,NS1能抑制TBK- 1活化内源性IRF 3所诱导的IFN -β启动子活性,约为对照组的1 4 ,TBK 1+IRF- 3共转染可使IFN- β启动子活性增高近10 0 0倍,NS1可使TBK -1活化外源性IRF 3所诱导的IFN- β启动子的活性降至对照组的约1 2至1 3。结论 流感病毒NS1可抑制TBK 1所致的IRF 3活化。

TBK-1基因免疫增强HBcAg核酸疫苗的特异性免疫应答

研究TBK-1基因免疫对HBcAg核酸疫苗诱导小鼠特异性体液免疫及细胞免疫的影响。采用pcDNA3.1(+)作为载体,构建真核表达质粒pcTBK-1;用HBcAg核酸疫苗(pc HBc)单独或联合质粒pcTBK-1免疫BALB/c小鼠,分别在第0、3、6周进行免疫,在第8周检测特异性抗体,脾脏淋巴细胞增殖,细胞因子IFN-γ及IL-4表达水平以及HBcAg特异性CTL活性等免疫学指标。结果显示,pc HBc联合pcTBK-1免疫小鼠的抗-HBc水平显著增高(P<0.05);淋巴细胞在体外经HBcAg刺激后,其增殖程度明显高于pc HBc单独免疫组(P<0.05);经HBcAg刺激后的淋巴细胞培养上清中,联合免疫组IFN-γ表达水平显著增高(P<0.05),而IL-4表达水平无明显改变(P>0.05);单独pc HBc免疫及联合免疫的小鼠中,HBcAg特异性CTL杀伤率均高于对照组,其中联合免疫组小鼠的CTL杀伤率显著增高(P<0.05)。提示TBK-1能够增强HBcAg核酸疫苗诱导的特异性体液免疫及细胞免疫应答,主要通过Th1型免疫应答途径,为HBV DNA疫苗的研究奠定了基础。

复方中药糖痹康对糖尿病周围神经病变大鼠PAI-1的影响

目的观察中药复方糖痹康对糖尿病大鼠坐骨神经血浆纤溶酶原激活物抑制物(PAI-1)表达的影响。方法 SD雄性大鼠60只,随机选取10只为正常组,其余大鼠采用高脂饲料和小剂量链脲佐菌素诱发2型糖尿病大鼠动物模型。造模成功后随机分为模型组、甲钴胺组,及糖痹康低、中、高剂量组,每组10只,采取相应干预。16周后取大鼠一侧坐骨神经及大鼠血清,用ELISE法检测大鼠血清PAI-1的含量,用Western blot方法检测坐骨神经组织中PAI-1的表达。结果与正常组比较,模型组大鼠血浆中PAI-1的含量升高,差异有统计学意义(P<0.01);经药物干预后,与模型组相比,各组大鼠血浆中PAI-1的含量均降低,差异有统计学意义(P<0.01);与正常组比较,模型组大鼠坐骨神经组织PAI-1蛋白表达明显升高,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,甲钴胺组和糖痹康低、中、高剂量组PAI-1蛋白表达均明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论中药糖痹康对糖尿病周围神经病变的神经保护作用可能与下调血浆PAI-含量及坐骨神经中PAI-1蛋白表达作用有关。

鸡TBK1基因实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

为测定鸡TBK1(chTBK1)基因在家禽抗感染天然免疫中mRNA表达水平变化情况,本研究根据chTBK1序列,设计3对特异性引物,基于chTBK1和β-actin双标准曲线建立了荧光定量PCR(qRT-PCR)检测方法,并测定在禽流感病毒刺激下鸡成纤维细胞(DF-1)中chTBK1表达量的变化情况。结果表明,建立的标准曲线Ct值与模板浓度的对数呈现良好的线性关系(R^2均大于0.99),能特异地检测chTBK1,检测灵敏度可达59拷贝数/μL,且组内及组间变异系数小于2%;chTBK1在DF-1细胞中的mRNA水平在病毒刺激下呈现上升趋势。该qRT-PCR检测方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,为研究chTBK1在鸡抗病毒感染中的作用提供了有效工具。