日本鳗鲡TBK1基因的克隆与免疫功能分析

为了阐明鱼类TANK结合激酶1(TBK1)在免疫应答密切相关的NF-κB、I型IFN及MAPK信号通路中的调控作用,本实验通过cDNA末端快速扩增技术(SMART RACE)从日本鳗鲡中克隆了TBK1基因cDNA全长序列,命名为AjTBK1,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测了在体和离体状态下不同病原体相关分子模式(PAMPs)及嗜水气单胞菌对日本鳗鲡AjTBK1基因表达水平变化的影响,通过构建绿色荧光蛋白pEGFP-TBK1和pCMV-TBK1真核表达质粒对AjTBK1亚细胞定位以及AjTBK1过表达对NF-κB、AP-1、IFN-β启动子荧光素酶活性的激活作用进行研究。蛋白质序列分析显示,日本鳗鲡AjTBK1编码731个氨基酸,其三维丝带空间结构与人类TBK1相似,具有保守的激酶结构域(KD)、泛素样结构域(ULD)、二聚化支架结构域(SDD)以及C端结构域(CTD),在系统发育树中与其他鱼类TBK1家族聚为一支。qRT-PCR检测发现AjTBK1在多种组织中广泛表达,且在肝脏和肠中高表达。经LPS、poly I:C、嗜水气单胞菌免疫注射后,AjTBK1基因表达水平在日本鳗鲡肝脏中显著提高,而肾脏中的表达量则在LPS和poly I:C刺激后显著降低。离体实验中,经LPS、poly I:C、PGN以及不同浓度嗜水气单胞菌刺激后的日本鳗鲡肝脏细胞AjTBK1基因表达水平均有显著升高。亚细胞定位结果显示,天然状态下的AjTBK1在HEK293细胞质中分布,经LPS和poly I:C刺激后呈聚集点状分布。此外,双荧光素酶活性检测发现过表达的AjTBK1可显著增强NF-κB、AP-1和IFN-β启动子荧光素酶活性。以上研究表明,AjTBK1可以通过激活NF-κB、AP-1和I型IFN信号通路,在机体抗细菌和抗病毒先天免疫应答中发挥重要的调控作用。

草鱼TBK1基因荧光定量PCR检测方法的建立

TANK结合激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1)基因在天然抗菌免疫中发挥重要作用,为研究该基因在草鱼(Ctenopharyngodon idella)抗病天然免疫中的表达水平,本研究根据已报道的草鱼TBK1基因(ciTBK1)序列,设计特异性引物2对,基于ciTBK1和18S rRNA双标准曲线建立了荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)检测方法。结果表明,建立的标准曲线Ct(Cycle thrshold)值与模板浓度的对数呈现良好的线性关系(R^(2)均大于0.99),建立的qRT-PCR检测方法能特异地定量检测ciTBK1基因,检测灵敏度可达50拷贝/μL,且组内及组间变异系数均小于5%。所建立的qRT-PCR检测方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性。

从CSF1R/STING/TBK1信号调控肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)表型极化探究加味白头翁汤治疗结直肠癌的效应机制

目的:观察加味白头翁汤对结直肠癌MC38细胞荷瘤小鼠瘤体生长及肿瘤组织中肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)浸润数量的影响,探析加味白头翁汤是否介导TAMs表型重塑以发挥抗肿瘤免疫调节效应。方法:首先构建鼠源MC38细胞株C57BL/6小鼠皮下移植瘤模型,设立模型组、阳性药奥沙利铂组(3 mg·kg^(-1))及加味白头翁汤高、低剂量组23.43、46.86 g·kg^(-1),每组各10只,另设立10只健康小鼠为空白组,观察各组小鼠体质量、瘤体体积及生存状态变化,摘取肿瘤组织、脾脏及外周血,计算瘤体体积变化、抑瘤率及脾脏质量;苏木素-伊红(HE)染色观察肿瘤组织病理形态学变化,免疫荧光实验检测荷瘤小鼠肿瘤组织中CD4、CD8、CD206表达水平,采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测荷瘤小鼠外周血清中细胞因子转化生长因子(TGF)-β、白细胞介素(IL)-6、趋化因子配体2(CCL2)的分泌水平;其次,使用MC38细胞株与鼠源单核巨噬细胞系RAW264.7细胞在体外构建IL-4诱导的共培养模型,细胞增殖与活性检测(CCK-8)法检测加味白头翁汤含药血清的细胞增殖抑制作用,Transwell实验检测IL-4诱导的M2型巨噬细胞对MC38细胞侵袭能力的影响,流式细胞术检测加味白头翁汤含药血清对IL-4诱导的M2型巨噬细胞干预后膜上CD86的表达变化,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测加味白头翁汤含药血清对共培养后M1型巨噬细胞相关极化因子CD86、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、IL-12及M2型巨噬细胞相关极化因子CD206、CD163、IL-10 mRNA表达水平的影响;最后,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测荷瘤小鼠肿瘤组织中集落刺激因子1受体(CSF1R)、干扰素基因刺激蛋白(STING)、TANK结合激酶1(TBK1)蛋白表达水平。结果:体内实验结果表明,与模型组比较,加味白头翁汤能明显抑制荷瘤小鼠瘤体的生长。免疫荧光实验结果表明加味白头翁汤能增加荷瘤小鼠肿瘤组织中CD8+T细胞浸润数量,降低CD206+TAMs浸润数量,且能下调荷瘤小鼠外周血清中细胞因子IL-6、TGF-β、CCL2的分泌水平;在体外实验结果中,加味白头翁汤含药血清无明显的细胞增殖抑制作用,但与RAW264.7细胞共孵育后的细胞上清液却能抑制MC38细胞的增殖活性,且IL-4诱导的M2型巨噬细胞能增强MC38细胞的侵袭能力,这一效应却能被加味白头翁汤含药血清呈浓度依赖性抑制。同时,Real-time PCR检测结果发现加味白头翁汤含药血清能上调M1型巨噬细胞相关极化因子CD86、iNOS、IL-12 mRNA表达水平,下调M2型巨噬细胞相关极化因子CD206、CD163、IL-10 mRNA表达水平,流式细胞术结果也证实了加味白头翁汤含药血清能增加CD86+M1型巨噬细胞复极化数量,这表明加味白头翁汤能诱导M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞复极化以发挥抗肿瘤生长作用。最后,Western blot检测结果表明加味白头翁汤能下调荷瘤小鼠肿瘤组织中CSF1R蛋白表达,上调STING、TBK1蛋白表达。结论:加味白头翁汤能下调CD206+TAMs浸润数量,增加CD8+T细胞浸润,从而发挥对结直肠癌生长抑制的抗肿瘤免疫调节效应,这可能与其调节CSF1R信号,进而活化STING/TBK1信号通路,诱导TAMs表型重塑有关。

Wip1通过STING-TBK1信号通路调控急性重症胰腺炎的进展

目的探讨野生型P53诱导的磷酸酶1(wild-type p53-induced phosphatase 1,Wip1)介导急性重症胰腺炎(server acute pancreatitis,SAP)演进的分子机制。方法取8周龄SD大鼠20只,随机分成空白组及SAP组。SAP组大鼠腹腔内注射雨蛙素50μg/kg,连续7次,每次间隔1h,末次注射6h后取血清及胰腺组织,空白组大鼠用等量灭菌注射用水替代,方法同SAP组,测定大鼠血清脂肪酶、淀粉酶、IFNβ、TNFα表达水平和大鼠胰腺组织中Wip1、干扰素基因刺激蛋白(stimulator of interferon genes,STING)、TANK结合激酶1(TANK binding kinase1,TBK1)和干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3,IRF3)蛋白表达情况。雨蛙素处理大鼠胰腺腺泡细胞AR42J细胞,在经雨蛙素处理后不同时间点检测细胞上清中淀粉酶、IFNβ和TNFα表达情况;检测Wip1、STING、TBK1、IRF3蛋白表达变化情况。经慢病毒转染AR42J细胞敲低Wip1表达后再予雨蛙素处理,检测细胞上清淀粉酶、IFNβ和TNFα表达情况,并且检测STING、TBK1、IRF3蛋白表达情况。结果1.雨蛙素刺激后大鼠血清淀粉酶和脂肪酶含量升高明显,并可诱导AR42J细胞上清淀粉酶含量增加;2.雨蛙素刺激胰腺组织中IFNβ、TNFα表达;且可促进AR42J细胞分泌IFNβ、TNFα,并随时间延长逐步增加;3.雨蛙素可刺激胰腺组织中Wip1、STING、TBK1和IRF3蛋白表达显著上调。并刺激AR42J细胞不同时间点Wip1、STING、TBK1和IRF3蛋白表达增加并呈时间依赖性;4.敲低Wip1基因降低雨蛙素诱导的细胞SAP模型中的细胞上清淀粉酶含量以及炎症因子IFNβ、TNFα水平。并下调雨蛙素诱导的细胞SAP模型中STING、TBK1和IRF3蛋白的表达水平。结论在雨蛙素诱导的SAP动物模型及细胞模型中,Wip1通过STING-TBK1信号通路的激活参与SAP的发展。

额颞叶痴呆合并肌萎缩侧索硬化的临床及遗传学特点:一例报道并文献复习

目的报道1例额颞叶痴呆合并肌萎缩侧索硬化(FTD-ALS)患者,回顾目前报道该病的相关文献,总结FTD-ALS的临床及遗传学特点。方法报道1例2017年5月就诊于安徽医科大学第一附属医院院的FTD-ALS患者,从患者及其一级亲属外周血提取DNA行遗传学检测。检索已详细报道的国人FTD-ALS病例,对该病的临床及遗传学特点进行总结分析。结果本例患者为49岁男性,临床表现为反应迟缓、逐渐加重的命名及词汇理解障碍,影像学提示颞叶萎缩;后逐渐出现饮水呛咳、多处肌肉萎缩伴肌束颤动,病理征及原始反射阳性,肌电图提示广泛神经源性改变,符合FTD-ALS诊断标准。在TBK1基因上发现有新发杂合突变(c.1335G>A chr12:64879792 p.W445X),参考美国医学遗传学和基因组学会相关指南提示该突变变异类型为疑似致病突变,但尚未被人类基因突变数据库报道过。目前国内外共报道有详细资料的中国FTD-ALS患者21例(包含本例),其中男性13例,女性8例,发病年龄(59.01±8.58)(44~73)岁,多数以FTD起病,继而出现ALS。已知有7例完善遗传学检测,其中5例有阳性结果,发生突变的分别为TBK1基因2例,C9orf72、DCTN1、TARDBP基因各1例。多数为散发型FTD-ALS(包含本例),仅2例为家族型FTD-ALS。结论FTD-ALS较为罕见,多以散发型为主,发病年龄较轻,痴呆以行为变异型FTD为主要表现,认知障碍多先于ALS;除C9orf72之外,TBK1也是FTD-ALS的重要致病基因,遗传学检测对该病诊断具有重要价值。