猪多杀性巴氏杆菌OmpW、TbpA蛋白的原核表达及免疫原性研究

【目的】研究猪多杀性巴氏杆菌OmpW和TbpA蛋白的免疫原性,探索其作为疫苗候选抗原的可能。【方法】对NCBI中不同血清群猪多杀性巴氏杆菌中OmpW和TbpA蛋白氨基酸序列进行相似性比对,并对OmpW和TbpA蛋白进行生物信息学分析。基于此,构建重组表达菌株pET28a-OmpW-BL21和pET28a-TbpA-BL21,重组OmpW和TbpA蛋白经镍柱亲和层析纯化后与氢氧化铝佐剂混匀制备亚单位疫苗,免疫小鼠后使用猪多杀性巴氏杆菌GX-PmD4菌株攻毒,评估OmpW和TbpA蛋白的免疫原性。【结果】相似性比对发现,OmpW和TbpA蛋白在不同血清群猪多杀性巴氏杆菌中高度保守;SignalP 6.0 Server和TMHMM Server v.2.0软件预测发现OmpW蛋白有信号肽和跨膜区,而TbpA蛋白有信号肽无跨膜区;ABCpred软件分析显示,OmpW和TbpA蛋白分别有14和22个B细胞抗原表位;SOPMA和SWISS-MODEL软件进一步预测蛋白结构表明:OmpW和TbpA蛋白的α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲分别占16.18%、5.39%、36.76%、41.67%和40.42%、5.69%、16.77%、37.13%。经原核表达获得的重组OmpW和TbpA蛋白均具有较强的抗原性。在免疫小鼠后的14和28 d,与对照组相比,血清中OmpW、TbpA特异性抗体水平极显著上升(P<0.01)。小鼠免疫攻毒试验结果显示,重组OmpW组和TbpA组的小鼠存活率分别为50.0%和37.5%。【结论】本研究成功表达了猪多杀性巴氏杆菌OmpW和TbpA蛋白,且重组OmpW蛋白免疫原性较强,可作为猪多杀性巴氏杆菌亚单位疫苗的有效候选抗原。

副猪嗜血杆菌血清5型TbpA蛋白的表达及其免疫原性分析

为原核表达副猪嗜血杆菌血清5型TbpA蛋白,本研究利用特异性引物扩增tbpA基因,并将其克隆到pMD18-T载体中进行序列测定。再将其亚克隆于pET-28a中构建重组表达质粒pET-tbpA。将其转化受体菌E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳和western blot分析表明,表达的重组蛋白约106 ku,并以包涵体形式存在。表达的重组蛋白经纯化后,免疫6周龄昆明小鼠制备免疫血清,ELISA分析表明制备的血清抗体效价在1∶3 200以上,表明TbpA具有良好的免疫原性。

副猪嗜血杆菌tbpA基因PCR-RFLP分型

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPs)是目前影响世界养猪业的重要病原之一。本试验利用针对HPs转铁蛋白基因tbpA的PCR-RFLP分型方法,对2003～2008年分离自江苏、上海、广西、浙江、江西和安徽等6省市的57个HPs分离株及15个参考菌株进行PCR-RFLP分析。结果显示,15个血清型参考菌株分为9种基因型,57个HPs流行分离株分为15种基因型,其中在我国最为流行的基因型分别为DBN(38%),ABN(18%)与DBP(12%)。本研究表明副猪嗜血杆菌在我国猪群中普遍存在,并至少有15个RFLP基因亚型,从而为我国HPs病的防治提供了重要理论依据。

陕西省副猪嗜血杆菌的分离及其基于tbpA基因的分型鉴定

【目的】检测副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)在陕西关中地区的感染状况,并对分离菌株进行基因型分析,为该地区副猪嗜血杆菌病的流行病学研究提供依据。【方法】从陕西关中地区14个发生多发性关节炎和浆膜炎的猪场采集30份病料,分离细菌,通过其培养特性和形态观察及生化试验和PCR等方法对分离株进行鉴定,并用Blast软件对分离株的16SrRNA序列进行同源性比对,同时对分离菌株进行了几种常见药物的敏感性检测。通过3种限制性内切酶TaqⅠ、AvaⅠ、AfaⅠ,对已被鉴定为副猪嗜血杆菌菌株的转铁结合蛋白A编码基因(tb-pA)进行PCR-RFLP基因分型。【结果】分离得到了5株疑似副猪嗜血杆菌菌株,经培养特性和形态观察、生化试验、PCR鉴定及序列同源性比对,将其鉴定为副猪嗜血杆菌。PCR-RFLP分型结果表明,从5株副猪嗜血杆菌分离株中共得到了4种基因型,分别为EBC、BBJ、EBJ、EAD。药物敏感性检测结果表明,分离菌株的耐药性均较强,且不同分离株对同一药物敏感性不同。【结论】副猪嗜血杆菌病在陕西关中地区猪群中流行比较严重,其基因型较多且与其他地域的菌株有一定差异。

红外光谱法研究TBPA对羊毛的阻燃作用机理

对比TBPA阻燃羊毛与非阻燃羊毛在不同温度下的红外光谱(IR)可以看到:阻燃羊毛在340℃时-CH_n吸收峰(2950～2899cm^(-1))和-NH_m吸收峰(1580～1490cm^(-1))已经消失,而到400℃时非阻燃羊毛中的-CH_n和-NH_m峰仍然存在。我们得出结论:溴不仅在气相发挥阻燃作用,而且通过氢转移阻燃机理在气-固两相同时发挥阻燃作用。

副猪嗜血杆菌安徽分离株的致病性与RELP基因型的相关性研究

为了研究PCR限制性酶切电泳长度多态性试验(PCR-RELP)与副猪嗜血杆菌(HPS)对豚鼠的致病性,本研究采用PCR-RELP分析12株HPS安徽分离株的tbpA基因,并将12株HPS分为5种不同的RELP基因型(AAA、BBB、BAB、BAC、CAB);12株HPS对豚鼠的致病性试验表明,致病性最强的RELP基因型为BAC,其次是AAA和CAB,无致病性的为BBB和BAB型。进一步分析12株HPS的tbpA基因序列系统进化关系发现,HPS的RFLP基因型的不同,其致病性存在差异,表明tbpA是影响HPS致病性的重要因素。

黄酮衍生物对大鼠体内甲状腺素结合前白蛋白的选择性竞争结合

合成的黄酮衍生物EMD_(21388)是T_4与甲状腺素结合前白蛋白(Thyroxine-bindingprealbumin,TBPA)结合的强烈抑制物。对大鼠全身使用EMD_(21388)后,血清TBPA与T_4结合即遭抑制,而白蛋白与T_4结合则增加,因而产生血清总T_4浓度降低,游离T_4百分率(FT_4％)增加以及血清TSH降低。提示在T_4与TBPA结合受抑,并与白蛋白结合增多的同时,由于血清T_4结合蛋白结合容量的减少,血清FT_4有短暂的增加;以及EMD_21388并不能通过血脑屏障。本文也进一步表明血清FT_4的稳定是垂体-甲状腺轴功能正常的十分重要的标志,以及大鼠血清游离甲状腺素的半衰期短于1h。

卡介苗D2株分泌蛋白基因植物表达载体的构建

目的 克隆卡介苗 (BCG)D2株 32 -kDa分泌蛋白基因 (fbpA基因 ) ,构建重组植物表达载体 pBI12 1-fbpA ,为研制转基因植物口服疫苗奠定基础。 方法 采用PCR法从BCGD2株基因组DNA中分离fbpA基因 ,构建重组克隆载体 pUCm -T -fbpA ,经过单菌落PCR法、BamHⅠ、SacⅠ和HindⅢ单 /双酶切、DNA序列分析鉴定后 ,将fb pA基因亚克隆入植物表达载体 pBI 12 1,得到重组载体pBI 12 1-fbpA ,并转化根癌农杆菌株EHA10 5 ,用PCR法对其进行鉴定。结果 重组载体 pUCm -T -fbpA测序后证实fbpA基因由 10 4 1bp组成 ,包括 1个 10 14bp的开放阅读框。DNA序列上游由编码一段信号肽的 12 9bp组成 ,并对 32 -kDa蛋白的分泌起决定作用。相应的编码成熟蛋白的序列由 885个碱基组成。fbpA基因与来源于BCG1173P2株的同一基因序列完全一致。此外 ,构建的重组植物表达载体 pBI12 1-fbpA成功转入根癌农杆菌株EHA10 5。结论 编码BCGD2株 32 -kDa分泌蛋白的fbpA基因分离成功 ,DNA序列分析证实fbpA基因在分枝杆菌中高度保守 ,为进一步深入分析fbpA基因以及研制抗结核病转基因植物疫苗奠定了基础。

阻燃大豆蛋白纤维的热性能研究

为了提高阻燃性,用四溴酞酐(TBPA)加有机二酸体系对大豆蛋白纤维进行了阻燃处理,然后用极限氧指数(LOI)、剩炭率表征了它的阻燃性能,用热分析和扫描电子显微镜研究了它的热性能。结果表明:与纯大豆蛋白纤维相比,阻燃处理后的大豆蛋白纤维的极限氧指数和剩炭率提高,热分解起始温度降低,阻燃性能得到了明显改进。

过氧乙酸叔丁酯热解特性分析及相容性研究

为分析过氧乙酸叔丁酯（TBPA）的热解危险性,采用差示扫描量热仪（DSC）、绝热量热仪（Phi-TEC II）和气质联用仪（GC/MS）,试验研究TBPA的热解特性以及酸碱与TBPA的相容性,分析TBPA热解产物,并推测可能的热解路径;根据Starink法和速率常数法确定热解反应动力学参数,推算绝热条件下最大反应速率到达时间（TMRad）为24 h时所对应的温度θd24结果显示,绝热条件下TBPA起始放热温度为83.0℃,绝热温升为214.5℃,θd24为63.46℃。研究表明：TBPA混合H2SO4溶液后,混合物热解起始放热温度降低,反应更为剧烈,而NaOH溶液对TBPA的热解危险程度影响不大,必须严格控制生产工艺温度及储运温度,并应在合成工艺中优先选择NaOH作为反应物,尤其需要注意酸性物质对TBPA热解的影响。

热点对过氧乙酸叔丁酯热失控过程的影响研究

为预防热失控,使用Fluent软件对工业尺度的反应釜进行计算流体动力学(CFD)模拟,探究热点对过氧乙酸叔丁酯(TBPA)热失控过程的影响。以系统散度判据为热失控临界判据,以热动力学和热分解产物分析结果为参数设置依据,使用多重参考系模型模拟反应釜内搅拌桨的转动,模拟分析液区顶部、1/4、1/2、3/4高度处和底部瞬时热点对热失控过程的影响。结果表明:瞬时热点使系统热失控大大提前;底部热点能够最快造成整体热失控,危险性最大;建议在液区顶部距轴线约1/2半径处和搅拌桨下部滞留区同时设置温度传感器,能够快速检测到可能存在的热点,避免发生热失控。