猪TCAP基因启动子克隆与活性分析

为了寻找鉴定与猪骨骼肌生长发育相关的基因,克隆了猪TCAP基因1 662 bp的核心启动子序列,通过软件预测,构建了7个缺失片段表达载体,转染PK细胞,确定了其核心启动子序列位于转录翻译起点上游0~155 bp之间。

猪TCAP基因转录因子的筛选与鉴定

克隆了猪TCAP基因1 662 bp的启动子序列,序列分析发现其启动子区域存在Myo D、Myo G、MEF2转录因子结合位点,并构建了3个转录因子超表达载体,分别与TCAP基因启动子载体共转染PK细胞。结果表明,3个转录因子使TCAP基因启动子活性升高,均正调控TCAP基因的表达。

肉质相关基因TCAP启动子与转录因子MyoD结合的ChIP分析

为了检测肉质相关基因TCAP(Titin-cap,Telethonin)启动子与转录因子MyoD(Myogenic differentiation antigen)的体内结合情况,采用染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)结合PCR技术分析TCAP启动子与转录因子MyoD的结合。结果表明,以MyoD抗体免疫沉淀的DNA片段为模板,PCR扩增获得了TCAP基因启动区121 bp的片段,实现了转录因子MyoD与TCAP启动子DNA序列结合。试验证实TCAP基因是MyoD调控的下游基因,在肌肉发育过程中发挥重要作用。

2个汉族肥厚型心肌病家系致病基因与TCAP基因的关系研究

目的:确定候选基因TCAP与两个汉族家系家族性肥厚型心肌病(HCM)之间的连锁关系。方法:在排除13个已知家族性HCM致病基因与这两个汉族家系家族性HCM的连锁关系基础上,选择TCAP基因作为这两个汉族HCM家系的候选致病基因,在其所在的染色体区域选取4个微卫星标记(Marker)进行单倍型连锁分析。结果:D17S1814、D17S838、D17Sac091178和D17S1818这4个微卫星标记在重组率θ=0时,家系1的LOD值在-2.689754^-0.645666范围内,家系2的LOD值在-1.396476~0.416726之间;在重组率θ=0.1时,两个家系中最大的LOD值仅为0.272605。结论:TCAP基因与这两个汉族家系的HCM无连锁关系,TCAP基因不是这两个家系的致病基因,提示这两个汉族家系的致病基因可能是全新的未知致病基因。

2G型肢带肌营养不良症斑马鱼疾病模型的构建

目的构建2G型肢带肌营养不良症(LGMD2G)斑马鱼疾病模型,并初步探讨其致病机制。方法通过CRISPR/Cas9基因编辑技术进行sgRNA制备、显微注射、tcap基因纯合突变斑马鱼筛选,构建tcap基因功能缺失的纯合突变斑马鱼。通过石蜡切片和苏木精-伊红(HE)染色观察野生型(WT)斑马鱼和tcap基因纯合突变斑马鱼的骨骼肌肌原纤维形态。使用新一代斑马鱼游泳速度测试系统检测WT斑马鱼(A组)和tcap基因纯合突变斑马鱼(B组)的最大游泳速度。将WT斑马鱼胚胎分别经空白处理、漂白剂处理、剪切损伤处理、加兰他敏处理,分别作为C、D、E、F组,采用原位杂交实验检测C~F组斑马鱼胚胎tcap mRNA表达情况。再将WT斑马鱼胚胎和M1型tcap基因纯合突变斑马鱼胚胎分为WT斑马鱼胚胎空白对照组(G组)、WT斑马鱼胚胎加兰他敏处理组(H组)、M1型tcap基因纯合突变斑马鱼胚胎空白对照组(I组)和M1型tcap基因纯合突变斑马鱼胚胎加兰他敏处理组(J组),应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测C~F组斑马鱼胚胎tcap mRNA相对表达量,检测G~J组斑马鱼胚胎p53和p21 mRNA的相对表达量。结果核酸电泳结果显示成功合成了长约100 bp的斑马鱼tcap基因编辑所需sgRNA;DNA测序结果显示筛选获得了2种tcap基因纯合突变斑马鱼。HE染色实验结果显示,与WT斑马鱼相比,tcap基因纯合突变斑马鱼的骨骼肌肌原纤维明显紊乱。斑马鱼最大游泳速度检测实验结果显示,相较于A组,B组斑马鱼的最大游泳速度显著降低(t=3.32,P<0.05)。原位杂交实验结果显示,与C组相比,D~F组斑马鱼胚胎中tcap mRNA表达量明显增加。RT-qPCR实验结果显示,C~F组斑马鱼胚胎中tcap mRNA相对表达量比较差异有显著性(F=21.70,P<0.05),其中D~F组明显高于C组(t=4.95~35.44,P<0.05);G~J组斑马鱼胚胎中p53和p21 mRNA相对表达量比较差异有显著性(F=8.45、33.04,P<0.05),其中J组明显低于H、I组(t=3.24~8.94,P<0.05)。结论成功构建了tcap基因功能缺失斑马鱼LGMD2G模型,tcap基因功能缺失导致p53基因下调可能是LGMD2G致病机制之一。

一例肢带型肌营养不良2G亚型患者的临床、病理及基因分析

目的探讨1例肢带型肌营养不良2G亚型（limb-girdle muscular dystrophy type 2G，LGMD2G）患者的临床、病理特点及基因突变情况。方法对l例LGMD2G患者进行临床资料收集及骨骼肌病理检查，PCR扩增患者TCAP基因的全部外显子，通过直接测序检测突变情况，并结合文献进行总结。结果该患者临床表现符合肢带型肌营养不良，骨骼肌病理可见镶边空泡肌纤维，基因检测发现LGMD2G致病基因亿4P基因存在复合杂合突变（c．100delC，c．166insG）。结论LGMD2G的诊断需综合患者临床、病理分析，但最终确诊需结合基因诊断。