2型糖尿病来源外泌体转运circ_001895对高糖胁迫下内皮祖细胞功能的影响

目的:探讨2型糖尿病(T2DM)来源的外泌体(EXO)中转运环状RNA_001895(circ_001895)对高糖胁迫下内皮祖细胞的增殖、凋亡、迁移及血管生成标志物的影响。方法:从T2DM患者中获取血清样本,分为血清组和EXO组。采用RT-qPCR技术检测血清和EXO中circ_001895的表达水平。将T2DM患者血清来源的EXO中circ_001895表达显著升高的EXO命名为EXO-circ。使用武汉普诺赛公司提供的内皮祖细胞进行培养,并分为以下3组:Ctrl组:常规培养24h,不进行额外处理。高糖(HG)组:以30mmoL/L葡萄糖处理细胞24h。HG+EXO-circ组:以30mmoL/L葡萄糖联合100μg/mL的EXO-circ处理细胞24h。采用RT-qPCR技术检测各组细胞中circ_001895的表达。使用CCK-8法检测细胞增殖活力。通过流式细胞术检测细胞凋亡情况。利用Western blot技术检测血管生成标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)的表达。通过Transwell细胞迁移实验检测细胞的迁移能力。结果:与血清组相比,EXO组中circ_001895的相对表达量显著上调(P<0.05)。与Ctrl组相比,HG组中circ_001895和E-cadherin的相对表达量及细胞凋亡率均显著上调(均P<0.05),而细胞增殖活力、迁移能力以及N-cadherin和Vimentin的相对表达量均显著下调(均P<0.05)。与HG组相比,HG+EXO-circ组中circ_001895和E-cadherin的相对表达量及细胞凋亡率均显著上调(均P<0.05),而细胞增殖活力、迁移能力以及N-cadherin和Vimentin的相对表达量均显著下调(均P<0.05)。结论:T2DM来源的EXO转运circ_001895抑制高糖胁迫下内皮祖细胞的增殖、迁移以及血管生成,并促进细胞的凋亡。

苦瓜皂苷L调控PI3K/AKT通路促进内皮祖细胞增殖能力和内皮功能的实验研究

目的:探讨苦瓜皂苷L对内皮祖细胞(EPC)增殖能力和内皮功能的作用及机制。方法:体外分离、培养、鉴定外周血EPC。使用不同浓度苦瓜皂苷L处理EPC 24 h后,应用细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测各组细胞活力。使用AutoDock Tools 5.6软件,分别以磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和蛋白激酶B(AKT)为受体,以药物分子苦瓜皂苷L为配体采用盲对接法进行分子对接。使用PI3K/AKT抑制剂LY294002和最佳使用浓度的苦瓜皂苷L单独或同时处理EPC 24 h后检测各组细胞活力和磷酸化PI3K(p-PI3K)、磷酸化AKT(p-AKT)及磷酸化内皮型一氧化氮合酶(p-eNOS)表达水平。结果:与对照组比较,苦瓜皂苷L呈剂量依赖性地促进EPC增殖,且40μmol/L的苦瓜皂苷L是最佳药物浓度。与对照组比较,LY294002可下调EPC细胞活力,苦瓜皂苷L可上调细胞活力。与苦瓜皂苷L组比较,共同使用苦瓜皂苷L和LY294002可降低细胞活力。分子对接结果显示,苦瓜皂苷L与PI3K和AKT均存在直接作用,形成稳定的锁钥结构。与对照组比较,LY294002可显著下调p-PI3K、p-AKT和p-eNOS蛋白水平;苦瓜皂苷L可上调p-PI3K、p-AKT和p-eNOS蛋白水平。与苦瓜皂苷L组比较,使用苦瓜皂苷L和LY294002可降低p-PI3K、p-AKT和p-eNOS蛋白水平。结论:苦瓜皂苷L通过PI3K/AKT信号通路靶向调节EPC的增殖能力,进而上调内皮型一氧化氮合酶(eNOS)活化水平以促进EPC内皮功能。

黄芩苷调控PI3K/Akt通路对过氧化氢诱导的内皮祖细胞损伤的保护作用

目的 探讨黄芩苷通过调控磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导的内皮祖细胞(EPCs)损伤的保护作用。方法 从SD大鼠骨髓中分离EPCs,并用荧光染色法进行鉴定。将EPCs细胞分为对照组、H_(2)O_(2)组(500μmol/L H_(2)O_(2)培养基培养细胞)、黄芩苷低、中、高剂量组(用30、60、120μg/ml黄芩苷分别预处理细胞24 h,再用500μmol/L H_(2)O_(2)培养基培养24 h)和黄芩苷高剂量+LY294002组(120μg/ml黄芩苷和10μmol/L LY294002分别预处理细胞24 h和1 h,再用500μmol/L H_(2)O_(2)培养基培养24 h)。噻唑蓝(MTT)法检测EPCs细胞活力;Hoechst33258核染色评价EPCs细胞凋亡;胱天蛋白酶(Caspase)-3荧光检测试剂盒检测EPCs细胞Caspase-3的活性;管形成实验检测EPCs细胞血管形成;试剂盒检测EPCs细胞内氧化损伤标志物[乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、活性氧(ROS)]水平;Western印迹检测EPCs细胞内凋亡B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、Caspase-3、PI3K/Akt通路相关蛋白表达。结果 培养的EPCs呈鹅卵石状,1,1-二十八烷基-3,3,3,3-四甲基林碳菁标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-ac-LDL)和异硫氰酸荧光素凝集素(FITC-UEA)-1阳性表达。H_(2)O_(2)降低细胞活力,增加凋亡率,减少Bcl-2/Bax比值,增加Caspase-3表达及相对Caspase-3活性,降低管形成能力和SOD水平,升高LDH、ROS、MDA水平,均有统计学差异(均P<0.05)。黄芩苷剂量依赖性地明显降低了H_(2)O_(2)诱导的EPCs凋亡率、Caspase-3表达、相对Caspase-3活性及LDH、ROS、MDA的释放,明显促进了管的形成、细胞活力和SOD产生,并明显升高Bcl-2/Bax比值(均P<0.05)。H_(2)O_(2)处理后EPCs中p-PI3K/PI3K与p-Akt/Akt比值均显著下降(P<0.05)。PI3K抑制剂LY294002阻断了黄芩苷对H_(2)O_(2)处理的EPCs的保护作用。结论 黄芩苷通过激活PI3K/Akt通路,保护EPCs免受H_(2)O_(2)诱导的细胞损伤。

大鼠周围神经损伤后外周血内皮祖细胞动员及相关因子含量变化

目的探讨大鼠周围神经损伤(PNI)后外周血内皮祖细胞(EPCs)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)水平变化及EPCs与其他指标的相关性。方法42只SD大鼠按随机数字表法分为对照组、PNI 1 d组、PNI 3 d组、PNI 5 d组、PNI 7 d组及PNI 14 d组,每组7只,除对照组外其余组均采用钳夹法建立坐骨神经损伤模型。对每组在预定时间点采用活体心脏穿刺法采血;采用Ficoll密度梯度离心法提取单个核细胞,CD34和CD133双阳性细胞标记EPCs,应用流式细胞仪检测各组EPCs数量。采用酶联免疫吸附试验检测各组外周血bFGF、VEGF及MMP-9含量,分析EPCs数量与bFGF、VEGF、MMP-9水平的相关性。结果与对照组相比,PNI 3 d组、PNI 5 d组、PNI 7 d组外周血EPCs数量升高,PNI 3 d组、PNI 5 d组、PNI 7 d组及PNI 14 d组外周血bFGF含量升高,其余各组外周血VEGF含量升高,PNI 5 d组、PNI 7 d组及PNI 14 d组外周血MMP-9含量升高(P<0.05)。PNI 5 d组和PNI 7 d组外周血EPCs数量与血清bFGF水平呈正相关(r分别为0.784和0.788,P<0.05),与血清VEGF水平呈正相关(r分别为0.889和0.852,P<0.05);PNI 5 d组、PNI 7 d组和PNI 14 d组外周血EPCs数量与血清MMP-9水平呈正相关(r分别为0.788、0.852和0.873,P<0.05)。结论EPCs与bFGF、VEGF和MMP-9共同参与了PNI后血供修复的病理生理过程。

Wnt信号通路与自身免疫调节因子共同参与胚胎干细胞向胸腺上皮祖细胞的分化

背景:自身免疫调节因子(autoimmune regulator gene,Aire)及Wnt信号通路在小鼠胚胎干细胞多能性的维持及分化中都发挥着重要作用,但Wnt信号与Aire是否参与了小鼠胚胎干细胞向胸腺上皮祖细胞的分化尚未可知。目的:探讨Wnt信号通路和自身免疫调节因子与胚胎干细胞分化的关系。方法:采用两步分化方法定向诱导小鼠胚胎干细胞分化为内胚层再分化为胸腺上皮祖细胞,然后用Aire shRNA慢病毒感染小鼠胚胎干细胞,嘌呤霉素筛选单克隆稳定株,再采用两步分化方法进行诱导分化,分别于定向诱导分化第0,3,10天,采用细胞免疫荧光、流式细胞术、Western blot、Real-Time qPCR检测相关基因及蛋白的表达变化。结果与结论:①定向诱导分化第0天,免疫荧光染色显示SSEA1、OCT4表达呈阳性;②定向诱导分化第3天,免疫荧光染色显示SOX17、FOXA2表达呈双阳性;③定向诱导分化第10天,流式细胞术结果显示EPCAM1、K5、K8表达呈阳性;④与未分化的小鼠胚胎干细胞相比,诱导分化的胸腺上皮祖细胞中Wnt7a、β-catenin、Gsk-3β蛋白表达升高,Aire蛋白表达降低;⑤与未分化的小鼠胚胎干细胞相比,诱导分化的胸腺上皮祖细胞中Wnt7a、β-catenin、Gsk-3β及Aire mRNA表达升高;⑥与正常培养的小鼠胚胎干细胞及其最终分化的胸腺上皮祖细胞相比,敲低Aire基因的小鼠胚胎干细胞及其最终分化的胸腺上皮祖细胞中Wnt7a、β-catenin、Gsk-3β蛋白表达水平降低。综上所述,Wnt信号通路和Aire共同参与了小鼠胚胎干细胞定向诱导分化为小鼠胸腺上皮祖细胞的过程。

CD34^(+)内皮祖细胞和内皮抑素在肾细胞癌组织中的表达

目的探讨CD34^(+)内皮祖细胞(EPCs)、内皮抑素(ES)在肾细胞癌(RCC)组织中的表达及其在RCC进展中的意义。方法应用免疫组化S-P法检测96例RCC组织和20例正常肾组织中CD34^(+)EPCs、ES蛋白的表达,并对其与各临床病理特征的关系进行分析。结果RCC组织中CD34^(+)EPCs、ES阳性率均高于正常肾组织的(χ^(2)=47.126,P<0.001;χ^(2)=41.184,P<0.001)。RCC组织中CD34^(+)EPCs、ES表达的与肿瘤大小、临床分期、病理分级有关(χ^(2)=13.942,P<0.001;χ^(2)=21.009,P<0.001;χ^(2)=11.107,P=0.004)。RCC组织中CD34^(+)EPCs与ES表达呈正相关(r=0.226,P=0.027)。结论CD34^(+)EPCs和ES在RCC发生、发展的过程中有着重要的作用,两者联合检测对RCC患者诊断、治疗和预后评估有指导意义。

DCE-MRI联合脂肪酸代谢组学评价兔糖尿病重症肢体缺血骨髓内皮祖细胞功能

目的 探究动态对比增强磁共振成像(dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging,DCE-MRI)微血管渗透性参数和脂肪酸代谢组学评价糖尿病(diabetes mellitus,DM)重症肢体缺血(critical limb ischemia,CLI)兔股骨上段骨髓内皮祖细胞(bone marrow endothelial progenitor cells,BMEPCs)功能。材料与方法 36只雄性新西兰大白兔中随机选取18只兔静脉注射四氧嘧啶构建DM模型兔,其中造模成功的DM兔12只,6只DM造模失败兔处以安乐死。12只DM兔和12只非DM兔行右侧股动脉结扎术分别作为DM合并CLI(DM+CLI)组和单纯CLI组,术后两组各存活10只。6只非DM兔手术暴露右侧股动脉不结扎作为假手术对照(Control)组(n=6),全部存活。各组在术后第0、4周行右侧股骨上段DCE-MRI检查,于术后第4周检测外周血内皮祖细胞和右侧股骨上段BMEPCs数量、BMEPCs迁移和血管生成功能以及骨髓液相色谱-质谱脂肪酸代谢组学,并计算骨髓微血管密度(microvessel density,MVD)。结果 与CLI组和Control组相比较,DM+CLI组术后第4周股骨上段骨髓Ktrans、Kep、Ve值增加(P<0.05),骨髓MVD减少,骨髓棕榈油酸、单不饱和脂肪酸/多不饱和脂肪酸比值以及硬脂酰辅酶A去饱和酶1活性指数减少(P<0.05),延长酶活性指数增加(P<0.05)。DM+CLI组BMEPCs动员、迁移和血管生成能力受损(P<0.05)。术后第4周右侧股骨上段骨髓Ktrans、Kep、Ve值、骨髓脂肪酸合成代谢相关指标均与BMEPCs迁移和血管生成功能存在相关性(P<0.05),对DM+CLI组和CLI组相关参数进行相关性分析,BMEPCs动员能力与Ktrans、Kep、Ve值呈负相关(P<0.05)。结论 DCE-MRI联合脂肪酸代谢组学评价DM+CLI兔骨髓BMEPCs功能是可行的,可以为调脂改善BMEPCs功能和预防截肢的病理生理机制提供定量影像学证据。

有氧运动对心肌梗死患者内皮祖细胞动员和功能的影响

背景:运动康复是心肌梗死患者非药物治疗的重要手段,能够改善心肌灌注和心血管功能,其机制可能与血管内皮细胞介导的血管新生与修复有关,而内皮祖细胞是血管内皮细胞的前体细胞。目的:探讨12周有氧运动对心肌梗死患者内皮祖细胞动员和功能的影响。方法:(1)选择2022年1-10月在郑州大学第一附属医院接受经皮冠状动脉介入治疗后的急性心肌梗死患者66例,按照随机数字表法分为运动组(n=33)和对照组(n=33),对照组患者接受常规心脏康复治疗12周,运动组患者接受常规心脏康复+12周有氧运动干预。干预前及干预结束后72 h,检测患者心肺适能、纽约心脏协会分级、左心室射血分数、血清肌钙蛋白Ⅰ和脑钠肽水平及外周血内皮祖细胞数量。(2)干预前及干预结束后72 h,从两组患者外周血中分离提取内皮组细胞,检测内皮组细胞的增殖、黏附和迁移能力。结果与结论:(1)干预结束后72 h,运动组患者的纽约心脏协会分级、血清肌钙蛋白Ⅰ和脑钠肽水平均低于干预前、对照组(P<0.05),峰值摄氧量、最大功率、递增负荷试验完成时间、峰值运动时左心室射血分数高于干预前、对照组(P<0.05),平均心率和平均主观疲劳感觉评分低于干预前、对照组(P<0.05),外周血内皮组细胞数量多于干预前、对照组(P<0.05);(2)干预结束后72 h,运动组患者外周血内皮祖细胞的增殖、黏附与迁移能力均高于干预前、对照组(P<0.05);(3)结果表明,规律有氧运动能够促进内皮祖细胞动员并增强其增殖、黏附和迁移能力,进而改善心肌梗死患者临床病情、心功能和心肺适能。

恩格列净通过调控AMPK/eNOS信号通路改善ox-LDL诱导的内皮祖细胞功能障碍

目的研究恩格列净(EMP)对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导内皮祖细胞(EPCs)损伤的保护作用及机制。方法通过密度梯度离心法提取、分离并培养小鼠骨髓来源的的EPCs。采用Dil标记乙酰化低密度脂蛋白(Dil-ac-LDL)联合FITC标记荆豆凝集素-1(FITC-UEA-1)双摄取法鉴定。将EPCs分为正常对照组,ox-LDL组以及ox-LDL联合不同浓度恩格列净实验组。CCK-8检测细胞活力,Transwell检测细胞迁移,FITC-Annexin V/PI检测细胞凋亡,ELISA检测细胞上清液中血管内皮细胞生长因子(VEGF)、基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)含量;流式细胞术检测一氧化氮(NO)的合成情况。Western blot检测AMPK、p-AMPK、eNOS、p-eNOS的蛋白表达。结果提取的EPCs诱导培养至第7天经鉴定为小鼠骨髓EPCs。与对照组比较,ox-LDL组细胞活力降低,迁移细胞减少,凋亡增加,VEGF、SDF-1α含量降低,NO合成减少(P<0.05);与ox-LDL组相比,不同浓度恩格列净组细胞活力有所提高,迁移细胞增多,凋亡减少,VEGF、SDF-1α含量升高,NO合成增加(P<0.05)。ox-LDL处理可明显抑制AMPK及eNOS磷酸化(P<0.05),恩格列净处理可以改善AMPK及eNOS磷酸化水平(P<0.05),而AMPK抑制剂Compound C可使恩格列净改善EPCs功能活性的作用受到明显的抑制(P<0.05)。结论恩格列净可改善ox-LDL诱导的EPCs功能障碍,其机制与调控AMPK/eNOS信号通路有关。

内皮祖细胞与间充质干细胞治疗血管支架相关疾病

背景:随着干细胞研究的发展,成体干细胞如内皮祖细胞和间充质干细胞在动脉粥样硬化、血管支架植入损伤并发症中的治疗效能逐渐被发现,由于静脉输注成体干细胞治疗疾病存在靶向性差、治疗效率低等问题,近年来对血管支架表面改性以实现内皮祖细胞或间充质干细胞的局部聚集与功能调节一直是研究的焦点。目的:论述内皮祖细胞、间充质干细胞在血管支架相关疾病中的治疗进展,以及基于内皮祖细胞、间充质干细胞的血管支架设计方面的研究现状。方法:在CNKI、万方、PubMed、Web of Science数据库检索建库以来发表的相关文献。中文检索词“内皮损伤,支架植入术,血栓,内膜增生,动脉粥样硬化,内皮修复,内皮祖细胞,间充质干细胞,血管支架”;英文检索词“endothelial injury,stenting,thrombosis,intimal hyperplasia,atherosclerosis,endothelial repair,endothelial regeneration,endothelial progenitor cell,mesenchymal stem cell,vascular stent,vascular scaffold”。根据纳入和排除标准,最终对127篇文献进行综述。结果与结论:内皮祖细胞、间充质干细胞能够通过分化以及旁分泌作用治疗动脉粥样硬化及支架植入损伤并发症,其作用机制主要包括保护内皮细胞、调节炎症细胞与炎症因子表达、调节平滑肌细胞增殖和表型等。间充质干细胞在治疗应用中可能伴有血栓、血管钙化等不良反应,使用细胞外囊泡、联合使用肝素进行表面设计是解决这一问题的可行方案。目前基于内皮祖细胞的支架研究较多,主要从内皮祖细胞的募集、捕获、增殖、分化与活性等方面进行支架表面改性;血管领域基于间充质干细胞捕获的支架研究较少,但间充质干细胞来源外泌体洗脱支架被发现具有极高的治疗效能。此外一些基础疾病如糖尿病可能会对成体干细胞活性造成影响,导致基于干细胞设计的支架失去效能,因而未来在设计相应的支架时,应注意考虑这方面的影响因素。

黄芪甲苷促进高糖受损的内皮祖细胞向内皮细胞分化的实验研究

目的:研究黄芪甲苷(AS-Ⅳ)诱导高糖损伤内皮祖细胞(EPCs)向内皮细胞(ECs)分化的作用。方法:体外分离出单个核细胞,通过4,6二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)核染法、FITC-UEA-I联合Dil-ac-LDL双荧光染色法鉴定EPCs,将鉴定成功的EPCs用30 mmol/L的葡萄糖干预120 h制成高糖受损模型,并随机分为高糖对照组及高糖AS-Ⅳ组,同时设置正常组。高糖AS-Ⅳ组加入100 mg/L的AS-Ⅳ干预,高糖对照组及正常组加入同等体积的PBS液培养。3组均培养48 h后采用荧光免疫检测内皮细胞标志物血小板-内皮细胞黏附分子(CD31)、血管性血友病因子(vWF)的表达情况,并通过Matrigel成管实验研究AS-Ⅳ干预EPCs成管分化的影响。结果:成功培养鉴定出EPCs,EPCs在光镜下形态呈中间圆形、外周梭形的“铺路石”样形态;双荧光染色荧光镜下EPCs呈双染橙黄色改变;免疫荧光检测显示,高糖AS-Ⅳ组CD31和vWF免疫荧光强度高于高糖对照组,差异有统计学意义(P<0.01);Matrigel成管实验显示,高糖AS-Ⅳ组EPCs成管能力高于高糖对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:AS-Ⅳ可诱导高糖受损人内皮祖细胞向内皮细胞分化而发挥体外成管作用。

黑枸杞花青素联合人脂肪源性血管外膜细胞支持脐血造血干/祖细胞的增殖

背景:黑枸杞花青素(Anthocyanins in Lycium ruthenicum Murr,ALRM)是黑枸杞中重要的活性成分之一,具有抗氧化、免疫调节等功效。人脂肪源性血管外膜细胞(CD146^(+)hAD-PCs)是骨髓间充质干细胞的前体细胞,在体外具有促进造血干/祖细胞增殖与分化的功能。ALRM联合CD146^(+)hAD-PCs对脐血造血干/组细胞的体外支持作用有待于研究。目的:探讨ALRM联合CD146^(+)hAD-PCs对脐血CD34^(+)造血干/祖细胞体外扩增的支持作用。方法:CCK-8法检测不同质量浓度ALRM(0,200,400,600,800,1000 mg/L)对CD146^(+)hAD-PCs增殖的影响;流式细胞术检测ALRM对CD146^(+)hAD-PCs细胞周期的影响。共培养实验分为空白组、ALRM组、CD146^(+)hAD-PCs组、ALRM+CD146^(+)hAD-PCs组,分析ALRM联合CD146^(+)hAD-PCs对脐血CD34^(+)造血干/祖细胞的体外支持作用。共培养1,2,4周,比较扩增后细胞数量、集落形成单位数量,流式细胞仪检测细胞免疫表型,ELISA检测细胞因子水平。结果与结论:(1)ALRM质量浓度为200 mg/L时,CD146^(+)hAD-PCs活力最高,CD146^(+)hAD-PCs的G_(0)/G_(1)期细胞比例下降,S期、G_(2)/M期细胞比例上升(P<0.01)。(2)脐血CD34^(+)造血干/祖细胞数量变化:在共培养1,2,4周时ALRM+CD146^(+)hAD-PCs组高于ALRM组(P均<0.05),在共培养2,4周时ALRM+CD146^(+)hAD-PCs组高于CD146^(+)hAD-PCs组(P均<0.05),ALRM组与空白组随着共培养时间延长细胞数量逐渐减少。(3)集落形成能力及免疫表型分析:在共培养1,2周时ALRM+CD146^(+)hAD-PCs组的集落形成单位数量高于CD146^(+)hAD-PCs组和ALRM组(P均<0.05);在共培养1,2,4周时ALRM+CD146^(+)hAD-PCs组CD45^(+)、CD34^(+)CD33^(-)细胞比例高于CD146^(+)hAD-PCs组(P均<0.01)。(4)细胞因子变化:在共培养4周时ALRM+CD146^(+)hAD-PCs组的白细胞介素2水平高于ALRM组、CD146^(+)hAD-PCs组(P<0.05);在共培养2,4周时ALRM+CD146^(+)hAD-PCs组白细胞介素3水平高于CD146^(+)hAD-PCs组(P<0.05);在共培养1周时ALRM+CD146^(+)h AD-PCs组的粒细胞集落刺激因子水平高于CD146^(+)hAD-PCs组,在共培养2周时高于ALRM组、CD146^(+)hAD-PCs组(P<0.01);在共培养1,2,4周时ALRM组、ALRM+CD146^(+)hAD-PCs组的干扰素γ水平低于CD146^(+)hAD-PCs组(P<0.05)。(5)由于空白组无基质细胞,脐血CD34^(+)造血干/祖细胞在共培养1周之后就无法计数,未进行免疫表型、集落分析和细胞因子检测。(6)结果表明:ALRM可以通过促进CD146^(+)hAD-PCs增殖和细胞周期转化进而促进脐血CD34^(+)造血干/祖细胞的体外扩增,在造血干细胞移植研究方面具有重要价值。

ABI家族成员3结合蛋白在血管紧张素Ⅱ诱导内皮祖细胞功能障碍中的作用及机制研究

目的探讨ABI家族成员3结合蛋白(ABI family member 3-binding protein,ABI3BP)在血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱导内皮祖细胞功能障碍中的作用及机制。方法为探讨ABI3BP在AngⅡ诱导内皮祖细胞功能障碍中的作用,将细胞分为4组,sh-NC组[转染阴性对照短发夹RNA(LV-scramble-shRNA)+磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)]、sh-ABI3BP组[转染ABI3BP shRNA(LV-ABI3BP-shRNA)+PBS]、sh-NC+AngⅡ组(LV-scramble-shRNA+AngⅡ)和sh-ABI3BP+AngⅡ组(LV-ABI3BP-shRNA+AngⅡ)。采用Transwell实验检测细胞迁移能力,黏附实验检测细胞黏附能力,Matrigel检测细胞成管能力,原位末端标记法检测细胞凋亡。Western blot检测整合素β1-黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)-P53信号通路变化情况。结果与sh-NC组比较,sh-NC+AngⅡ组迁移细胞数量、黏附细胞数量、小管形成数量显著降低,细胞凋亡率、整合素β1、磷酸化FAK(p-FAK)/FAK及P53蛋白表达显著增高,差异有统计学意义(P<0.05)。与sh-NC+AngⅡ组比较,sh-ABI3BP+AngⅡ组迁移细胞数量[(88.67±8.33)个vs(62.33±7.37)个]、黏附细胞数量[(104.33±6.03)个vs(68.33±10.05)个]、小管形成数量[(36.33±3.21)个vs(19.33±3.06)个]显著增高,细胞凋亡率、整合素β1、p-FAK/FAK及P53蛋白表达水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论AngⅡ可上调ABI3BP表达,敲低ABI3BP基因表达可改善AngⅡ诱导的内皮祖细胞功能障碍,其机制可能与抑制整合素β1-FAK-P53信号通路有关。

大鼠骨髓单个核细胞诱导扩增为内皮祖细胞的细胞分离方法、接种数目、培养瓶包被条件

目的筛选大鼠骨髓单个核细胞(BMMNCs)诱导扩增为内皮祖细胞(BM-EPCs)的细胞分离方法、接种数目、培养瓶包被条件,构建一个高效、高产量、高纯度的骨髓来源BM-EPCs分离培养诱导扩增方法。方法取2周龄雄性SD大鼠,脱颈处死后分离大鼠双侧胫骨和股骨,收集骨髓细胞悬液。配制30%、50%、60%和70%浓度的Percoll细胞分离液,通过Percoll密度梯度离心法分离出大鼠BMMNCs种子细胞,并计算活细胞比例。将获得的BMMNCs分为1×10^(5)、5×10^(5)、1×10^(6)、2.5×10^(6)、5×10^(6)、1×10^(7)六个组别,分别接种于25 cm^(2)无菌培养瓶中,培养7 d后镜下观察各组细胞集落形成数目,并计算每10^(6)细胞的集落形成数。运用Graphpad prism9.5软件进行Logistic拟合曲线,根据相关系数R^(2)确定相关性,根据其P值将有统计学差异的接种数目纳入范围,随后使用R语言编程定义计算函数,根据已知种子细胞总数及相关性函数限制下,通过迭代寻找最佳的BMMNCs细胞接种数目。分别配制20、50、100 nmol/L浓度的人纤连蛋白(FN)溶液,以不添加FN的空白溶液为对照,分别包被空白培养瓶2、6、12、24 h,将收集的48 h未贴壁BMMNCs接种于FN包被的各培养瓶中,静置培养3 d后计算各组集落形成数目,确定FN包被的最佳浓度与时间。接种48 h未贴壁BMMNCs于25 cm^(2)培养瓶底,使用EGM-2完全培养基定向诱导,于显微镜下观察集落形成及诱导扩增进程。取培养14 d的BM-EPCs,分别采用双阳性染色法和流式细胞术鉴定BM-EPCs的纯度。结果使用Percoll分离法可把BMMNCs细胞清晰的分为5层,其中30%与50%Percoll细胞分离层之间为BMMNCs活细胞比率最高。BMMNCs的最优接种数目为2.5×10^(6)个。以50 nmol/L的FN溶液包被24 h或以100 nmol/L的FN溶液包被6 h皆可有效促进细胞集落形成。细胞接种7 d后获得形态良好的铺路石样细胞并建立生长优势,表明BMMNCs已经诱导成为形态良好的BM-EPCs。Dil-Ac-LDL/FITC-UEA-1双阳性细胞占比为91.89%±5.77%,CD31+KDR阳性率为90.73%±0.61%、CD14阳性率为0.53%±0.17%、CD45阳性率0.77%±0.34%,说明获得的BM-EPCs纯度良好。结论大鼠BMMNCs诱导扩增为BM-EPCs过程中,可使用Percoll密度梯度离心法分离BMMNCs,BMMNCs的最优细胞接种数目为2.5×10^(6)个,细胞培养瓶包被条件为以50 nmol/L的FN溶液包被24 h或以100 nmol/L的FN溶液包被6 h,分离培养诱导获得的BM-EPCs形态和纯度均良好。

TNF-α和VEGF协同作用小鼠胚胎干细胞衍生的血管内皮祖细胞促伤口愈合

皮肤伤口愈合是世界范围内的重大临床难题之一,血管生成和炎症反应是影响伤口愈合和组织再生的关键环节。内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPC)在血管内皮修复和招募炎症细胞促伤口愈合过程中发挥重要作用。然而,体内直接输送EPC低效且会损害细胞存活力和功能进而影响治愈效率。因此,改善EPC的生物学功能以促进伤口愈合很有必要。本研究将小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESC)在10 ng/mL VEGF和5 ng/mL bFGF的作用下诱导获得CD133+CD34+EPC。以mESC衍生的EPC为研究对象,将外源性肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)作用于mESC-EPC,结果表明,10 ng/mL TNF-α和10 ng/mL VEGF协同处理组相比于单因子处理显著促进EPC的黏附、细胞迁移和管腔形成能力(P<0.01)。进一步通过建立小鼠局部皮肤全层创伤模型,在创周处注射10 ng/mL TNF-α和10 ng/mL VEGF协同EPC治疗明显加速伤口愈合(P<0.05),再生皮肤真皮层增厚(P<0.001),促进血管生成素ANG1和ANG2介导CD31+内皮细胞构成的毛细血管网络成熟。随着伤口愈合程度的加深,促炎因子TNF-α在蛋白质水平的表达下调(术后13 d,PBS组、EPC组、VE组、TE组和VTE组的TNF-α相对表达量分别为0.73±0.01、0.60±0.02、0.42±0.02、0.36±0.01和0.34±0.03),创造有利于伤口愈合的炎症微环境。综上所述,10 ng/mL TNF-α和10 ng/mL VEGF的协同作用强化EPC的生物学功能,并通过促进新血管生成和早期炎症反应加速小鼠皮肤伤口闭合和组织重塑,为细胞干预伤口愈合治疗提出新的思路。

二甲双胍对妊娠期糖尿病患者外周血内皮祖细胞及氧化应激水平的影响

目的 探究二甲双胍对妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)患者外周血内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)及氧化应激水平的影响。方法 选取收治的98例GDM患者,随机分为对照组(n=49)和观察组(n=49),对照组给予常规干预和门冬胰岛素治疗,观察组在对照组治疗的基础上给予二甲双胍辅助治疗。比较2组的血糖水平[空腹血糖(fasting blood-glucose,FBG)、餐后2小时血糖(2-hour postprandial blood glucose,2 hPG)和糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin,HbA1c)]、胰岛素抵抗和胰岛素水平[胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment of insulin resistance,HO-MA-IR)、空腹胰岛素(fasting insulin,FINS)和饭后1 h胰岛素(insulin 1 h after meal,1 h INS)]、外周血EPCs百分比和数量以及氧化应激水平[谷胱甘肽(glutathione,GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(malonaldehyde,MDA)]。结果 治疗后,与对照组比较,观察组的FBG、2 hPG、HbA1c、FINS、1 hINS、HO-MA-IR和MDA均明显较低(P<0.05),外周血EPCs数量和百分比、GSH和SOD均明显较高(P<0.05)。结论 针对GDM患者,在常规干预和门冬胰岛素治疗的基础上给予二甲双胍辅助治疗可更好地控制血糖水平,改善胰岛素抵抗和胰岛素水平,提高外周血EPCs的增殖能力,下调机体氧化应激水平。

内皮祖细胞外泌体中miRNA-222-3p对糖尿病小鼠皮肤伤口愈合的影响

目的了解内皮祖细胞外泌体(EPCs-Exo)中的miRNA-222-3p对糖尿病小鼠皮肤伤口愈合的影响。方法采用荧光染色法对C57BL/6小鼠骨髓来源内皮祖细胞(EPCs)进行鉴定。对从EPCs培养基中分离出的EPCs-Exo进行鉴定以及miRNA高通量测序。建立糖尿病小鼠皮肤损伤模型,随机分为5组:PBS组、EPCs-Exo组、空白组、agomiR-222-3p组、antagomiR-222-3p组。根据不同分组,连续处理14 d,观察创面愈合率,免疫荧光方法了解治疗前后创缘组织中活性氧(ROS)、血管内皮生长因子(VEGF)、CD31表达水平变化。结果EPCs-Exo促进糖尿病小鼠皮肤伤口愈合,降低创缘组织中ROS表达水平,增加VEGF、CD31表达水平(P<0.05)。高通量测序提示miRNA-222-3p在EPCs-Exo中高度表达。创缘组织局部皮下注射miRNA-222-3p可显著促进糖尿病小鼠皮肤伤口愈合,降低创缘组织中ROS表达水平,增加VEGF、CD31表达水平(P<0.05)。结论miRNA-222-3p促进糖尿病小鼠伤口愈合,在EPCs-Exo促进创面愈合过程中发挥重要作用。

过表达肝细胞生长因子的内皮祖细胞移植促进坐骨神经挤压伤修复的研究

目的探讨过表达肝细胞生长因子(HGF)慢病毒转染的内皮祖细胞对大鼠坐骨神经损伤的修复作用。方法体外实验方面,提取大鼠骨髓的内皮祖细胞(EPC)并利用DiI-acLDL和FITC-UEA-1双染法进行鉴定。EPC转染慢病毒后采用qRT-PCR实验检测HGF基因表达水平。采用CCK-8实验、Transwell实验以及血管形成实验对转基因EPC的体外功能进行评估。体内实验方面,随机将25只SD大鼠平均分为5组,即对照组(Con组)、正常EPC组(N-EPC组)、空载病毒转染EPC组(LV-NC组)、过表达HGF病毒转染EPC组(LV-HGF组)和假手术组(Sham组)。各组大鼠暴露出右侧坐骨神经后,在坐骨神经分叉处上方10 mm处使用止血钳形成2 mm宽的坐骨神经挤压伤,假手术组在暴露神经后不做处理;分别将转染空载慢病毒EPC、转染过表达HGF慢病毒EPC或正常EPC与基质胶按1∶1体积比混合后注入伤处神经外膜下,而对照组不注入EPC。术后4周,运用Catwalk检测大鼠运动功能的恢复情况,电生理实验检测神经传导功能的恢复情况,透射电镜观察髓鞘厚度,甲苯胺蓝染色观察神经纤维密度,腓肠肌湿重称重检测肌肉萎缩程度,马松染色检测各组手术侧的腓肠肌肌纤维面积。结果体外实验结果显示,与正常EPC组相比,LV-HGF组EPC在CCK8实验中细胞增殖速度更快(P<0.05),Transwell实验中细胞迁移速率更高(P<0.01),在血管形成实验中形成更多血管状结构(P<0.01)。动物实验结果显示,LV-HGF组的坐骨神经功能指数值显著高于其他3组(Con组,P<0.01;N-EPC组,P<0.01;LV-NC组,P<0.01);复合肌肉动作电位波幅更高(Con组,P<0.01;N-EPC组,P<0.05;LV-NC组,P<0.05);再生坐骨神经的髓鞘较厚(Con组,P<0.01;N-EPC组,P<0.01;LV-NC组,P<0.01);有髓神经纤维密度更高(Con组,P<0.01;N-EPC组,P<0.05;LV-NC组,P<0.05);腓肠肌湿重比值更高(Con组,P<0.01;N-EPC组,P<0.01;LV-NC组,P<0.01);肌纤维平均面积较大(Con组,P<0.01;N-EPC组,P<0.05;LV-NC组,P<0.05);LV-HGF组以上实验结果与Sham组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。结论过表达HGF基因可以增强EPC的增殖、迁移及分化功能。在坐骨神经挤压伤后,HGF基因转染的EPC相较于正常EPC,能更明显地促进了受损周围神经结构和功能的恢复,其机制与促进受损周围神经的轴突再生及髓鞘形成有关。

基于CiteSpace的糖尿病内皮祖细胞研究文献的可视化分析

目的基于CiteSpace探讨糖尿病内皮祖细胞领域的研究热点和趋势,旨在为该领域研究提供参考和方向。

钱鹏旭研究员/高建青教授团队报道造血干/祖细胞膜包被脂质体用于靶向骨髓进行白血病药物递送

2024年7月7日,浙江大学基础医学院/良渚实验室钱鹏旭课题组联合浙江大学药学院/金华研究院高建青团队在《自然·通讯》(Nature Communications)在线发表了题为“Hematopoietic stem and progenitor cell membrane-coated vesicles for bone marrow-targeted leukaemia drug delivery”的研究论文(DOI:10.1038/s41467-024-50021-9),报道了将造血干/祖细胞(HSPC)细胞膜与脂质体结合制备载药纳米粒,利用HSPC归巢到骨髓的特性,实现靶向骨髓递送白血病药物。