Klotho基因真核表达载体的构建及其在TCMK-1细胞中的稳定表达

目的构建小鼠Klotho基因真核表达载体,进而获得稳定表达Klotho分子的小鼠肾上皮细胞株TCMK-1。方法应用PCR方法扩增带有FLAG标签的Klotho编码基因,并克隆至载体pCD-CXIN(CMVMCS-IRES-Neomycin)的相应位点;经酶切及测序鉴定重组质粒,脂质体转染TCMK-1细胞,通过G418筛选得到稳定表达Klotho分子的TCMK-1细胞株;Real-Time PCR检测Klotho mRNA水平,Western blotting检测Klotho蛋白的表达。结果将带有FLAG标签的Klotho基因重组表达载体转染至TCMK-1细胞后,经G418筛选获得TCMK-1细胞株。与对照组相比,Klotho mRNA和蛋白表达均显著升高。结论成功构建了Klotho基因的重组表达载体,并获得了稳定表达Klotho基因的TCMK-1细胞株,为进一步研究Klotho基因和蛋白在小鼠肾上皮细胞中的作用奠定了基础。

TRPM7在肾脏缺血再灌注损伤中的表达变化

目的 :瞬时受体电位M7(transient receptor potential melastatin 7,TRPM7)为1种具有离子通道和激酶特性的双功能膜蛋白,在缺血再灌注损伤中发挥重要的作用,但TRPM7在肾脏缺血再灌注损伤中的变化和作用尚不完全清楚。本研究探讨TRPM7在体内和体外肾脏缺血再灌注损伤模型中的变化。方法:建立体外肾小管上皮细胞TCMK-1不同方式的缺氧复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)模型,包括物理H/R(1%O2)以及Co Cl2化学H/R模型,并建立体内小鼠肾脏缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion,I/R)模型。采用实时聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction,RTPCR)方式检测H/R以及I/R不同时间点细胞或组织中TRPM7 m RNA或蛋白的表达变化。结果 :TCMK-1细胞物理H/R模型中TRPM7 m RNA表达在再灌注24 h达到最高;而在化学H/R模型中,TRPM7 m RNA表达在再灌注12 h达到最高;TCMK-1细胞物理H/R模型中,TRPM7蛋白含量在再灌注24 h达到最高。在体内肾脏I/R模型中,TRPM7 m RNA在再灌注5 d达到最高。结论:TRPM7在肾脏I/R损伤过程中起重要的作用,提示TRPM7可能是肾脏I/R损伤过程中的一个潜在的治疗靶点。