白藜芦醇缓解低氧/复氧诱导的TCMK1细胞线粒体自噬

目的研究白藜芦醇(Res)对低氧/复氧(H/R)导致小鼠肾小管上皮细胞系TCMK1内线粒体功能及线粒体自噬的影响。方法体外建立H/R细胞模型,经Res或(和)线粒体自噬抑制剂1(Mdivi-1)预处理TMCK1细胞2 h,采用CCK8法检测TCMK1细胞存活率;试剂盒法检测钙离子超负荷情况;流式细胞测量术测定线粒体膜电位(MMP)变化和活性氧(ROS)含量;Western blot检测线粒体融合蛋白(OPA)、分裂蛋白(DRP)以及凋亡相关蛋白cleaved caspase-3,Bax,Bcl2表达;免疫荧光检测线粒体外膜转位酶(TOMM20)和自噬溶酶体相关膜蛋白2(LAMP2)共定位情况。结果与对照组相比,H/R组TCMK1细胞存活率显著减低(P<0.05),细胞内钙离子、ROS及MMP含量显著减低(P<0.05),OPA表达显著减低(P<0.05),同时DRP表达显著增高(P<0.05),线粒体与LAMP2共定位的细胞数目显著减少;与H/R组相比,10μmol/L Res可以显著增加TMCK1细胞的存活率(P<0.05),抑制细胞内ROS的释放、钙离子超负荷及MMP的下降(P<0.05),同时促进OPA表达而抑制DRP表达(P<0.05),增加线粒体与LAMP2共定位的细胞数目。与(H/R+Res)组相比,在其基础上给予Mdivi-1后,凋亡执行蛋白Bax、cleaved caspase-3蛋白表达升高,抗凋亡蛋白Bcl2表达降低(P<0.05)。结论Res缓解H/R诱导的TCMK1细胞损伤,至少部分通过激活线粒体自噬,维护线粒体动力学稳态而实现。

利用CRISPR/Cas9技术构建Pmepa1基因敲除的TCMK1小鼠肾小管上皮细胞系

【目的】利用CRISPR/Cas9技术构建Pmepa1基因敲除的TCMK1小鼠肾小管上皮细胞系,并探讨Pmepa1敲除对TGF-β刺激下TCMK1细胞纤维化的影响,为研究Pmepa1在纤维化模型中的作用提供细胞模型。【方法】根据CRISPR/Cas9设计原则设计靶向小鼠Pmepa1基因组序列的sgRNA序列,构建pX333载体并转染进入TCMK1细胞,采用流式分选m Cherry阳性细胞、单克隆细胞扩增和测序鉴定Pmepa1敲除细胞,Western blot验证Pmepa1基因敲除情况。采用RT-PCR和Western blot分析Pmepa1敲除对TGF-β1诱导的R-Smad的活化和纤维化的影响。【结果】将sgRNA设计在Pmepa1第2个外显子,pX333-Pmepa1质粒转染TCMK1细胞48 h后,观察到mCherry荧光蛋白的表达,流式细胞分析转染效率约为17%,pX333-Pmepa1质粒转染阳性细胞经流式分选和单克隆扩增培养,得到19个细胞克隆,对Pmepa1基因位点上sgRNA靶点序列PCR扩增测序分析发现2个双等位基因移码突变细胞,Western blot验证Pmepa1蛋白表达缺失,表明Pmepa1基因敲除TCMK1细胞株构建成功,与未敲除细胞相比,Pmepa1敲除细胞在TGF-β1刺激下,p-Smad2和p-Smad3的表达显著升高,并且促进纤维化基因Fibronectin和Collagen I的表达。【结论】利用CRISPR/Cas9技术成功构建Pmepa1基因敲除TCMK1小鼠肾小管上皮细胞系,为Pmepa1蛋白的功能研究建立了细胞模型以及Pmepa1在纤维化中的重要作用。