脑胶质瘤中长链非编码RNA TCONS_00008552促进放疗抵抗、侵袭转移的机制

目的以人胶质瘤放疗抵抗株M059K与放疗敏感株M059J为实验模型,筛选出与放疗抵抗相关的LncRNA TCONS_00008552,并初步研究其对胶质瘤放疗抵抗、侵袭转移的影响。方法在M059K、M059J 细胞中分别干扰和过表达TCONS_00008552,通过MTT 实验、平板克隆形成、划痕实验、Transwell 侵袭实验,检测其对胶质瘤细胞增殖、放疗敏感性以及侵袭转移的影响。结果MTT 实验显示TCONS_00008552可以增强胶质瘤细胞的增殖;划痕实验和Tanswell侵袭实验表明,该LncRNA增加胶质瘤细胞的迁移和侵袭能力;平板克隆形成实验和Western Blot结果显示,其可促进胶质瘤细胞的放疗抵抗,减轻放疗辐射诱导的细胞凋亡。结论LncRNA TCONS_00008552在胶质瘤放疗抵抗株中高表达,并促进肿瘤细胞的放疗抵抗、迁移和侵袭。

低氧诱导的长链非编码RNA 68在肝癌中的功能及其作用机制

目的·探究肝癌细胞系中受低氧诱导的长链非编码RNA 68(hypoxia-induced long non-coding RNA 68,HILRNA68)的功能以及其相关机制。方法·利用长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)芯片研究低氧(hypoxia)与常氧(normoxia)分别处理12 h的肝癌细胞系SMMC-7721中表达变化的lncRNA,通过R语言DEseq2程序包分析低氧下表达显著变化的lncRNA,并利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)验证差异lncRNA。通过短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)稳定敲除细胞内的低氧诱导因子(hypoxia inducible factors,HIFs)用以研究低氧下HILRNA68转录是否受HIFs的调控。通过细胞核浆分离,结合qRT-PCR检测以及RNA荧光原位杂交技术(RNA fluorescence in situ hybridization,RNA-FISH)实验研究HILRNA68的亚细胞定位。通过小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)分别在SMMC-7721和MHCC-97H细胞中敲低HILRNA68以研究其在低氧下的细胞功能。通过细胞生长计数实验以及Transwell细胞侵袭实验分别探究低氧下HILRNA68对肝癌细胞的生长增殖以及侵袭转移能力的影响。此外,通过双荧光素酶报告基因实验研究敲低HILRNA68后是否抑制HIF1α的转录活性。结果·通过对lncRNA芯片的结果进行差异基因分析,共得到247个升高和17个降低的lncRNA[定义为倍数变化(fold change)≥4,伪发现率(false discovery rate,FDR)≤0.05]。在差异基因中发现HILRNA68在多个经低氧处理的细胞系中均稳定升高约10倍。低氧下敲低HIF1α、HIF2α、HIF1β均显著抑制HILRNA68的升高(均P<0.05),荧光素酶报告基因实验表明其转录受到HIFs的调控。亚细胞定位研究表明HILRNA68主要定位于细胞核。细胞功能实验结果表明敲低HILRNA68显著抑制肝癌细胞SMMC-7721与MHCC-97H在低氧下的增殖以及侵袭能力(均P<0.05)。机制研究表明,敲低HILRNA68显著抑制低氧下HIF1α的转录活性(P<0.05);HIF1α靶基因在低氧下的升高在敲低HILRNA68后被显著抑制(P<0.05)。结论·研究鉴定出一批低氧下表达显著变化的lncRNA,并功能注释了其中升高的HILRNA68。HILRNA68受HIFs调控而升高,升高后促进细胞低氧下的增殖以及侵袭转移能力;机制上,HILRNA68低氧下表达升高后促进HIF1α的转录活性。

猪lncRNA TCONS00791383对骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

为了探究lncRNA TCONS_00791383对猪骨骼肌卫星细胞增殖和分化的影响。本研究利用qRT-PCR技术检测出生7 d内大白仔猪6种组织(心、脾、肺、肾、背肌和腿肌)以及猪骨骼肌卫星细胞增殖分化前后TCONS_00791383的表达水平;通过设计反义核苷酸(antisense oligonucleotides,ASO)片段在猪骨骼肌卫星细胞中对TCONS_00791383进行敲低,检测敲低TCONS_00791383之后增殖分化标志基因的表达量变化;通过trans(co-expression)对TCONS_00791383进行靶基因预测,使用DAVID对其进行GO富集和KEGG通路分析。结果显示,TCONS_00791383在猪心脏中表达量最高,在脾和肾组织中不表达。在骨骼肌卫星细胞从增殖到分化的过程中,TCONS_00791383的表达量逐渐上升,且在分化后30 h表达量达到最高。在使用ASO片段敲低TCONS_00791383之后,与对照组相比,在分化24 h,增殖标志基因Pax3、Pax7表达量显著或极显著降低(P<0.05,P<0.01),分化标志基因MyoG表达量极显著降低(P<0.01),在分化48 h,增殖标志基因Pax3表达量极显著降低(P<0.01),Pax7表达量显著降低(P<0.05),分化标志基因MyHC表达量显著降低(P<0.05)。预测得到的相关靶基因富集到AMPK、ATP等多个与骨骼肌卫星细胞增殖和分化过程相关的重要信号通路。本研究表明,lncRNA TCONS_00791383可能促进猪骨骼肌卫星细胞的增殖和分化。

Lnc RNA TCONS_00022381在胃癌组织中的表达及其对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响

目的检测LncRNA TCONS_00022381在胃癌组织中的表达,探讨其对胃癌SGC-7901细胞增殖的影响。方法qPCR法检测Lnc RNA TCONS_00022381(TCONS)在胃癌和癌旁组织中的表达;将胃癌细胞系SGC-7901细胞分为siRNA干扰组、阴性对照组和空白对照组,采用脂质体2000转染法将靶向TCONS的siRNA和阴性对照si RNA分别转染,空白对照组不予任何处理。转染48h后采用q PCR法进行抑制效率的鉴定;MTT法检测各组细胞增殖情况;Western blot法检测各组细胞增殖核抗原PCNA的表达情况。结果LncRNA TCONS_00022381在胃癌组织中的相对表达显著高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。Lnc RNA TCONS_00022381的si RNA能够显著抑制其在SGC-7901细胞中的表达(P<0.05)。MTT实验可见siRNA干扰组较阴性和空白组相比,增殖活力显著下调(P<0.05),PCNA的表达显著下调(P<0.05)。结论LncRNA TCONS_00022381在胃癌组织中显著高表达,对胃癌细胞具有促进增殖的作用。

TCONS_00016478通过PGC1-α/ PPARγ信号通路影响实验性房颤兔心房肌能量代谢重构的机制

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)TCONS_00016478通过调控过氧化物酶增殖物激活受体γ辅助激活因子1α(PGC-1α)/过氧化物酶增殖物激活受体γ(PPARγ)信号通路影响实验性房颤兔心房肌能量代谢重构的机制。方法采用高通量二代测序技术检测房颤兔/非房颤兔右心房组织差异性表达lncRNAs,成年新西兰白兔18只,体质量2.0～2.5 kg,雌雄不拘,随机分为假手术组(行开胸术但不注射病毒)、阴性对照慢病毒组(右心房注射阴性对照慢病毒)和TCONS_00016478沉默慢病毒组(右心房注射TCONS_00016478沉默慢病毒),每组6只。感染病毒前及感染1周后分别使用心脏电生理仪行程序电刺激,检测心房有效不应期(AERP)与房颤诱发性。感染病毒1周后处死动物,取心房肌组织,采用qRT-PCR法检测RNA的表达,采用Western blotting法检测蛋白质的表达,采用PAS染色法和油红O染色法分别检测糖原和脂滴沉积。结果与感染病毒前相比,感染病毒1周后,TCONS_00016478沉默慢病毒组AERP缩短(80.667±1.453 vs 71.750±2.411,t=3.168,P=0.034);假手术组(80.083±1.044 vs 79.333±0.333,t=0.684,P=0.531)与阴性对照慢病毒组(81.083±2.599 vs 80.000±2.646,t=0.022,P=0.983)手术前后AERP差异无统计学意义。TCONS_00016478沉默慢病毒组病毒感染1周后,3只诱发房颤,假手术组和阴性对照慢病毒组均未诱发房颤。假手术组、阴性对照慢病毒组及TCONS_00016478沉默慢病毒组心房肌TCONS_00016478(F=126.042,P<0.001)、PGC-1α(F=43.998,P<0.001)、PPARγ(F=417.863,P<0.001)、葡萄糖转运蛋白-4(GLUT4)(F=98.043,P<0.001)及碱棕榈酰转移酶-1(CPT1)(F=105.096,P<0.001)基因表达量均差异有统计学意义。与假手术组相比,TCONS_00016478沉默慢病毒组心房肌TCONS_00016478在基因水平表达量降低(P<0.001),与能量代谢相关的蛋白质PGC-1α、PPARγ、GLUT4、CPT1在基因水平表达量降低(P<0.001),蛋白质水平表达量亦下降,差异有统计学意义(P<0.001);生物信息学分析表明,lncRNA TCONS_00016478及其靶基因PGC-1α与心肌能量代谢密切相关。心房肌细胞糖原和脂滴异常沉积。结论 TCONS_00016478通过调控PGC-1α/PPARγ信号通路影响心房肌能量代谢重构,进而调控房颤发生。

LncRNA TCONS_00003757在甲状腺乳头状癌中的作用

目的探讨长链非编码RNA(LncRNA)TCONS_00003757在甲状腺乳头状癌中的表达意义以及对甲状腺乳头状癌TPC-1细胞增殖、侵袭能力的影响。方法收集2017年10月至2018年3月于唐山市工人医院手术切除的甲状腺乳头状癌标本以及对应的癌旁正常组织共60例,采用实时定量PCR技术检测甲状腺乳头癌组织中LncRNA TCONS_00003757的表达水平,并分析其与患者临床病理资料的关系。应用小干扰RNA(siRNA)沉默TPC-1细胞中LncRNA TCONS_00003757和ST3GAL5的表达,通过MTT、细胞侵袭实验、划痕实验检测LncRNA TCONS_00003757和ST3GAL5对甲状腺乳头状癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响,应用Western印迹法检测LncRNA TCONS_00003757对ST3GAL5表达的影响。结果LncRNA TCONS_00003757在甲状腺乳头状癌组织中表达水平显著高于癌旁正常组织(P<0.05),并与有无淋巴结转移和腺外侵犯显著相关(P<0.05)。LncRNA TCONS_00003757在TPC-1细胞中的表达水平显著高于正常人甲状腺滤泡上皮Nthy-ori 3-1细胞(P<0.05);沉默LncRNA TCONS_00003757和ST3GAL5的表达,抑制了甲状腺癌TPC-1细胞的增殖、侵袭和迁移,并且沉默LncRNA TCONS_00003757可降低ST3GAL5的表达(P<0.05)。结论LncRNA TCONS_00003757在甲状腺乳头状癌中表达显著增加,且与甲状腺乳头状癌的发生发展相关。沉默LncRNA TCONS_00003757可能通过降低ST3GAL5的表达抑制甲状腺乳头状癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。