CRISPR/Cas9敲除内源TCR增强TCR-T细胞对HPV16阳性宫颈癌SiHa细胞的杀伤

目的:基于CRISPR/Cas9基因编辑技术制备无内源TCR的TCR-T细胞并鉴定其在体外杀伤HPV16阳性宫颈癌SiHa细胞的功能。方法:培养健康志愿者外周血CD8^(+)T细胞和Jurkat细胞,CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除CD8+T、Jurkat细胞的TCR基因,制备过表达转基因TCR的重组慢病毒,在敲除内源性TCR的CD8^(+)T和Jurkat细胞中用慢病毒过表达转基因TCR制备TCR-T细胞,多色FCM检测TCR-T细胞中TCR和CD3的表达水平,荧光素酶活性实验检测TCR-T细胞对HPV16阳性SiHa细胞的杀伤效率。结果:CRIPSR/Cas9基因编辑技术高效地敲除了外周血CD8^(+)T细胞和Jurkat细胞中的TRAC和TRBC基因,敲除效率分别为(81.4±4.5)%、(98.5±0.07)%,制备的无内源TCR的TCR-T细胞高效表达转基因TCR,在外周血CD8^(+)T和Jurkat细胞中表达率为(66.0±17.8)%、(97.3±2.6)%,敲除内源TRAC和TRBC基因有效增强CD8^(+)T和Jurkat细胞膜表达转基因TCR(均P<0.01),敲除内源TCR增强TCR-T细胞特异性杀伤HPV16阳性的SiHa细胞[(71.4±1.0)%vs(35.1±2.0)%,P<0.01)]。结论:无内源TCR的TCR-T细胞显著增强转基因TCR的表达和对HPV16阳性宫颈癌SiHa细胞的靶向杀伤能力,为提高TCR-T细胞的临床疗效提供了实验依据。

首例TCR-T细胞治疗晚期胰腺癌的伦理审查实践

回顾性报告北京大学深圳医院伦理委员会对院内开展的首例TCR-T技术治疗晚期胰腺癌个案研究进行伦理评估、讨论、审查和做出决定的情况,讨论的问题包括该案例的性质、风险获益评估、知情同意以及风险控制。最后提出加强创新性治疗研究项目的监管,运用医患共同决策模式实行充分有效的知情同意和提升伦理实质审查能力等三个方面的建议,以期为伦理委员会审查细胞治疗等前沿技术的临床研究项目提供参考。

TCR-T过继免疫疗法及其在妇科肿瘤中的研究进展

T细胞受体基因工程改造的T细胞(TCR-T)是一种新兴肿瘤过继免疫疗法,是从肿瘤患者体内鉴定出含有肿瘤抗原特异性的TCR,在体外经T细胞扩增、克隆和分选提取出目标TCR基因序列;将TCR基因序列与载体结合并侵染宿主体内T细胞,得到TCR基因工程改造的T细胞对肿瘤细胞起到特异性免疫效果,最终达到杀灭肿瘤细胞治疗肿瘤的目的。在目前,该疗法在妇科肿瘤领域的应用仍处于临床Ⅰ、Ⅱ期临床试验阶段,已显示出较好的安全性和可行性;但是,目前已经完成的临床试验样本总量较小,患者疗效和预后因所用方法不同而存在较大差异,其安全性和有效性仍在检验过程中。

TCR-T细胞治疗技术的研究进展

手术、放化疗作为传统治疗手段虽然在一定程度上能改善患者的生存率和预后,但仍然不能革命性地改观肿瘤患者的生存情况。TCR-T细胞治疗作为肿瘤免疫治疗中的重要部分,因在实体瘤中的成功应用,被认为是迄今最有前景的肿瘤免疫治疗方式之一。本文就TCR-T细胞免疫疗法的历史背景、TCR-T细胞免疫疗法原理、特异性TCR-T细胞治疗技术及其应用前景进行综述。

实体肿瘤TCR-T治疗研究的现状与面临的挑战

T细胞表面含有特异性的T细胞受体(T cell receptors,TCR),能够识别不同的肿瘤抗原,从而实现对癌变细胞的杀伤和清除。TCR工程化T细胞(TCR-engineered T cells,TCR-T)治疗即是通过钓取针对肿瘤细胞的特异性TCR,并应用基因工程技术改造T细胞,输注体内后可达到治疗肿瘤的目的。尽管TCR-T治疗取得一定成果,但是还存在治疗毒性、T细胞浸润有限、抗原特异性不佳等问题,需要不断优化TCR-T治疗的安全性和有效性。因此,本文阐述了目前国内外关于实体肿瘤TCR-T治疗的研究现状以及存在的问题与对策。

肿瘤精准靶向免疫治疗的关键:T细胞受体抗原筛选技术

过继性T细胞疗法在实体瘤治疗中展现了良好的前景,成为目前肿瘤治疗领域的一大研究热点。其中,TCR-T疗法主要通过T细胞受体(TCR)与抗原肽-主要组织相容性复合体(pMHC)的特异性识别,进而激活过继性T细胞的抗肿瘤免疫反应。因此,全面解析TCR所靶向的抗原信息有助于提高TCR-T疗法在临床应用中的有效性及安全性。然而,高效、高通量的TCR抗原筛选技术的缺乏限制了TCR-T疗法的发展。近年来,随着高通量测序技术、质谱流式细胞技术和计算生物学的快速发展,研究人员开发了多种TCR抗原筛选技术用于解析TCR及其特异性识别的抗原信息。本文从抗原定向筛选、TCR定向筛选以及双向筛选三方面对TCR抗原筛选技术进行归纳总结,系统介绍其优缺点,展望TCR抗原筛选技术领域的发展前景,为未来抗原筛选技术的开发提供了新思路。

TCR-T细胞免疫疗法治疗肝细胞癌的研究现状及策略

肝细胞癌是原发性肝癌的主要病理类型,目前的临床治疗方法难以达到理想的效果,迫切需要探索新的、有效的治疗方法。T细胞受体基因工程改造T细胞(TCR-T)疗法因在实体瘤中的成功应用,被认为是最有前景的免疫治疗方式之一。本文主要从TCR-T治疗在肝细胞癌中的研究进展进行综述,并针对性提出一些解决策略,包括优化TCR亲和力、降低毒性反应、减少外源性和内源性TCR双链错配、改善肿瘤微环境、促进TCR-T细胞扩增。

TCR-T细胞疗法的开发与产业化

近年来肿瘤免疫疗法在肿瘤治疗中获得重大突破,主要包括免疫检查点抑制剂、过继性细胞治疗以及肿瘤疫苗等。过继性细胞治疗中嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)-T、T细胞受体(T cell receptor,TCR)-T疗法均发展迅速,CAR-T在血液疾病中的疗效显著,但在实体瘤中治疗中疗效不甚理想。TCR-T疗法被普遍认为在实体瘤治疗中更具有潜力,且已在一些临床试验中获得令人鼓舞的临床效果。本文将从TCR-T简介、与CAR-T的差异、开发流程、临床进展、企业研发及存在的挑战等方面对TCR-T疗法进行综述。

TCR-T治疗中靶点选择的策略

T细胞受体工程化T细胞(TCR-T)治疗是目前肿瘤免疫细胞过继治疗研究领域的热点之一,近年,TCR-T治疗取得了突破性进展,在肿瘤免疫治疗中发挥越来越重要的作用。本文将综述目前TCR-T基础研究和临床应用方面的进展,分析不同类型肿瘤抗原对TCR-T治疗有效性的影响,为癌症细胞免疫治疗提供新思路。

TRBC1作为潜在靶点治疗T细胞来源肿瘤的研究进展

T细胞来源肿瘤具有侵袭性、易耐药且预后不良的特点,常规治疗后复发率高,目前对于其的治疗不存在特效药。若能改进早期诊断和治疗手段,将有效改善患者的预后。细胞免疫治疗对B细胞来源的血液系统肿瘤获得较高的治愈率。却因为缺乏合适的靶点对治疗T细胞来源血液系统肿瘤的免疫治疗效果不佳。最新发现的T细胞受体β链恒定结构域1(TRBC1)作为一个潜在的治疗靶点,给T细胞来源肿瘤的诊断和治疗带来希望。本文将对TRBC1在当前的疾病诊断和细胞免疫治疗中研究进展进行综述。

合成生物学与工程化T细胞治疗

近年来,工程化T细胞治疗在肿瘤免疫治疗领域取得了重大进展。工程化T细胞治疗主要包括T细胞受体基因工程T细胞(T-cell receptor-engineered T cell,TCR-T)疗法和嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)疗法,其中,CAR-T疗法在恶性血液肿瘤中展现出了巨大的潜力和应用价值,而TCR-T疗法则在部分实体瘤中呈现出了较好的治疗效果。然而,针对大部分肿瘤,特别是实体肿瘤,当前工程化T细胞疗法还存在效率低、安全性不足等问题。通过合成生物学手段使工程化T细胞克服当前限制,将为研制更安全、高效的工程化T细胞带来新的机遇。本文将从工程化T细胞的结构和信号激活、靶点选择、亲和力优化、安全性改造以及基因编辑改造等方面综述工程化T细胞的合成生物学改造策略,并探讨这些优化措施在肿瘤免疫治疗应用中的最新进展。

肿瘤患者T细胞受体多样性和克隆性的高通量测序分析

目的:探讨肺癌和食管癌患者外周血T细胞受体(T cell receptor,TCR)多样性和克隆分布,以及食管癌外周血和肿瘤浸润淋巴细胞中T细胞TCR的差异情况。方法:收集自2019年4月至2021年5月郑州大学第一附属医院未行放、化疗,并排除严重感染性疾病、自身免疫性疾病以及近期使用免疫抑制剂治疗史的8例食管癌、8例肺癌患者的外周血标本,选取其中1例食管癌患者肿瘤组织标本进行TCR测序。17例健康人外周血标本作为对照组。分析肿瘤患者与健康人之间以及早期、晚期肿瘤患者之间TCR多样性指数(D50)、VJ基因使用频率以及CDR3序列克隆型频率的差异。结果:食管癌、肺癌患者外周血TCR CDR3序列的D50值[分别为(0.031±0.028)和(0.077±0.034)],均低于健康人[(0.145±0.057),P<0.000 1和P=0.005 3]。食管癌、肺癌外周血TCR CDR3最大克隆比例[分别为(10.640±7.640)%和(8.334±5.575)%],均高于健康人[(4.070±2.341)%, P=0.003 1和P=0.011 9]。且TCR CDR3序列的最大克隆比例与D50值呈负相关。食管癌和肺癌患者早期外周血T细胞TCR多样性(D50)[分别为(0.057±0.028)和(0.106±0.007)]明显高于晚期患者[分别为(0.015±0.014,P=0.028 5)和(0.059±0.030,P=0.041 7)]。随着疾病进展,肺癌和食管癌患者外周血TCR CDR3中TRBV和TRBJ基因组合使用减少,单个或多个TCR克隆型占比明显增高,存在明显的单一性。结论:肺癌和食管癌中外周血TCR谱多样性低于健康人,且存在克隆性增殖。在肿瘤发展中,TCR谱多样性降低,提示TCR谱为肿瘤的诊断、免疫评估提供了潜在的生物标志物,具有重要的临床指导意义。

免疫细胞疗法在实体瘤治疗中的挑战与对策

近年来,以T淋巴细胞为主的免疫细胞疗法在血液系统肿瘤和部分实体瘤中取得了一定的进展。然而,其对大部分实体瘤治疗的有效性和安全性仍面临着诸多挑战,如肿瘤抗原异质性和免疫逃逸、免疫细胞浸润能力差、免疫抑制微环境、代谢微环境阻碍和T细胞耗竭等,这些问题限制了免疫细胞对实体瘤治疗的疗效进一步的提升。通过寻找新抗原、设计多靶点CAR、过表达趋化因子受体及细胞因子、敲除抑制性信号分子、增强T细胞代谢能力、联合免疫检查点抑制剂,以及表观遗传修饰等手段能够有效改善免疫细胞在实体瘤治疗中的效果。本文系统性地对TIL、TCR-T细胞和CAR-T细胞为代表的免疫细胞对实体瘤治疗的研究现状、面临的挑战和解决策略进行评述。

基于TCR组库分析流程的非小细胞肺癌特征分析

目的·探究非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)免疫相关特征,发掘V-J基因中的肿瘤潜在标志物,为建立T细胞受体(T-cell receptor,TCR)-抗原识别预测模型提供基础。方法·收集704例NSCLC样本,用于构建一套系统的TCR组库分析流程,涵盖从原始数据到质控、过滤、TCR序列的识别和提取等上游分析部分,以及组库克隆分布、克隆分型、V-J基因共享性、互补决定区3(CDR3)分布特征以及克隆追踪等下游分析流程。使用Shannon-Weiner指数、Chao1等指数分析样本克隆分布。根据克隆扩增数目进行克隆分型,以探索不同分型间的差异。选取2例甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)样本进行去克隆扩增权重V-J基因共享分析,以探究低频克隆型对V-J基因共享性的影响。最后,通过分析V基因及高频克隆型CDR3分布特征和克隆追踪分析,监测肿瘤免疫前后克隆型频率的变化,寻找潜在的肿瘤标志物。结果·①NSCLC不同组织间克隆分布和克隆分型均存在显著差异,且在不同年龄与性别间存在显著差异。②在V-J基因共享性分析中发现了特定高共享V-J基因,同时在CDR3分布特征分析中存在非正态分布的高克隆V基因与氨基酸高频克隆型。③高频克隆型克隆追踪分析中,观察到NSCLC中高表达或新表达的高频克隆型,提示这些克隆型可作为潜在的肿瘤相关抗原或新抗原结合CDR3参考序列。④通过去克隆扩增权重V-J基因共享分析,发现原本低表达的TRBJ2-5基因表达频率显著增加,提示该基因可能为肿瘤免疫反应的潜在低频关键基因。结论·TRAV21和TRBV6.5基因在NSCLC中高克隆扩增,可作为潜在肿瘤标志物。

基因工程T细胞的临床研究进展

尽管手术和放化疗等传统治疗手段在肿瘤治疗方面取得了很大进展,但在改善肿瘤患者预后和生存等方面仍不令人满意。近年来,肿瘤免疫治疗领域发展迅速,出现了多种效果良好的免疫治疗药物和技术[1-6]。免疫治疗已经成为肿瘤综合治疗的重要手段,甚至在不久后有可能成为肿瘤治疗的主要手段。在这些免疫治疗新技术中,基因工程T细胞的发展尤为令人瞩目[7]。多项临床研究[8-11]显示,基因工程T细胞能够有效清除机体内恶性细胞,甚至能够长期缓解病情。该文将介绍基因工程T细胞的临床研究进展,并探讨该领域在中国的发展。

T细胞受体嵌合型T细胞治疗肿瘤的研究进展

T细胞受体基因工程改造的T细胞治疗法是以修饰T细胞为基础的肿瘤过继免疫治疗方法,可以凭借其对肿瘤特异性抗原的高亲和性识别能力,在人体内起到很强的抗肿瘤免疫效应。近些年来肿瘤免疫疗法已成功应用到黑色素瘤、滑膜肉瘤和多发性骨髓瘤等实体肿瘤上,部分患者肿瘤消退,但也不乏出现细胞因子释放综合征和毒性作用等不良反应的现象。

规范管理促进免疫细胞治疗技术的健康发展

肿瘤免疫治疗（包括免疫细胞治疗和免疫分子治疗）被认为是继手术、放疗和化疗后一种新的肿瘤治疗模式,是当前国际上治疗肿瘤等疾病基础和临床研究的热点。免疫治疗由于对一些肿瘤的疗效明显,于2013年被Science杂志评为年度十大科技突破之首。如CD19特异性CAR-T细胞治疗急、慢性淋巴细胞白血病和晚期B细胞淋巴瘤疗效明显，部分患者病情得到长期缓解；在治疗实体瘤方面的研究也越来越多受到关注。

T细胞受体工程化T细胞抗肿瘤治疗的现状与挑战

T细胞受体工程化T细胞(T cell receptor-engineered T cells,TCR-T)是目前肿瘤免疫治疗领域的研究热点之一,从2006年首个临床试验成功至今已经取得了一系列令人鼓舞的成果,但快速发展的同时其在杀伤性、安全性、持久性这三方面仍面临着许多问题。改善肿瘤免疫微环境,增强TCR-T的趋化、浸润与活化将是提高其杀伤肿瘤作用的关键;新抗原具有高度的肿瘤特异性与免疫原性,是保障治疗安全有效和实现个体化肿瘤免疫治疗的基础;另外,回输低分化的T细胞亚群是产生持久免疫应答的可靠方法。本文将结合当前的研究进展,从以上三个角度阐述TCR-T抗肿瘤治疗的现状与挑战。

乳腺癌过继性细胞免疫治疗的研究进展

目前国际上取得重大进展的四类过继性细胞免疫治疗(ACT)技术主要包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、CAR-T细胞、TCR-T细胞和CAR-NK细胞治疗。乳腺癌相关研究结果表明,TIL能预测乳腺癌的预后,间质TIL增加与良好的预后相关;CAR-T细胞免疫治疗在血液系统肿瘤治疗中取得巨大突破后,现已用于靶向实体肿瘤治疗,并在乳腺癌的治疗中开展了多种靶点的临床试验;TCR-T细胞疗法依赖于MHC,可以识别MHC分子呈递的任何抗原,具有更广泛的靶抗原,在治疗实体瘤方面更有前景,多项乳腺癌TCR-T细胞治疗临床试验正在进行中;CAR-NK细胞治疗是通过借鉴CAR-T细胞的结构而设计的,具有出色的抗肿瘤能力,比CAR-T细胞疗法更安全,可能将为肿瘤免疫治疗带来新的更大发展。ACT在乳腺癌的研究和临床应用领域仍具挑战,其中TIL疗法难以产生足量的特异性T细胞,CAR-T和CAR-NK细胞疗法均不同程度存在细胞的持久性、快速归巢到肿瘤床、毒性和转导效率等问题。尽管存在不足,但随着基因工程、肿瘤免疫学和分子生物学等多学科的迅速发展,相信ACT技术有望为乳腺癌患者治疗带来新的希望。

正常人外周血和脐血中TCRVβ亚家族sjTRECs的检测情况

目的:检测TCR23个Vβ亚家族sjTRECs在正常人外周血中的存在特点,从而进一步了解正常人胸腺近期各Vβ亚家族初始T细胞的输出情况。方法:采用半巢式PCR对4例胸腺、10例脐血和10例正常人外周血分别在2×105、5×104、1×104和1×103个单个核细胞中的23个Vβ亚家族sjTRECs进行扩增。结果:在细胞数相同的情况下,各Vβ-Dβ1sjTRECs的检出率胸腺细胞最高,其次是脐血,正常人最低。当细胞数为2×105、5×104和1×104时,正常人Vβ2、Vβ4、Vβ7、Vβ11和Vβ19亚家族sjTRECs的检出率以及检出sjTRECs的亚家族数量均显著低于脐血。当细胞数为2×105和5×104时,正常人可检测到绝大多数Vβ亚家族的sjTRECs,随着细胞数的降低,部分Vβ亚家族的sjTRECs则检测不到,而少部分Vβ亚家族的sjTRECs则在1000个细胞时仍能检测到。结论:成功建立了半定量检测23个Vβ亚家族sjTRECs的检测方法;在2×105细胞中约可以检测到80%左右的Vβ亚家族初始T细胞,而在5×104细胞中约有半数的Vβ亚家族初始T细胞可检测到,提示不同Vβ亚家族初始T细胞的出现频率有所差异。