利用慢病毒载体构建过表达人TCRP1基因的慢性髓系白血病K562细胞系及其生物学功能检测

目的利用慢病毒载体构建过表达人舌癌耐药相关基因(TCRP1)的慢性髓系白血病(CML)K562细胞系并检测其生物学功能。方法将TCRP1的重组质粒与包装质粒共转染293T细胞,收集病毒液测定滴度后感染K562细胞,使用嘌呤霉素筛选TCRP1过表达的细胞株K562/TCRP1,荧光定量PCR和Western blot方法检测TCRP1的表达,采用连续细胞计数法和CCK-8法分别对K562/TCRP1及其对照细胞株的增殖情况进行检测,并分析2个细胞株对不同浓度的伊马替尼(IM)的药物敏感性。结果TCRP1慢病毒表达载体成功转染进入K562细胞,荧光定量PCR和Western blot结果显示K562/TCRP1细胞株的TCRP1表达在mRNA水平和蛋白水平均显著高于对照组,连续细胞计数法和CCK-8法结果表明K562/TCRP1细胞的增殖能力和细胞活力增强,IM处理K562/TCRP1细胞的IC50值显著高于其对照细胞(P<0.05)。结论利用慢病毒载体成功构建了TCRP1过表达的K562细胞株,并且发现TCRP1的过表达可能增强K562细胞的增殖能力和IM耐药能力,为进一步探讨TCRP1在慢性髓系白血病发病机制中的可能作用提供基础。

TCRP1在口腔鳞癌中介导顺铂耐药的体内实验研究

目的 TCRP1是新近从舌癌耐药细胞系Tca8113/PYM中克隆出来的一个新基因,前期体外实验研究表明TCRP1在口腔鳞癌细胞中能特异地介导对顺铂化疗耐受,本研究将进一步探讨TCRP1在体内实验中介导化疗耐受的作用。方法通过建立TCRP1过/沉默表达裸鼠移植瘤模型,观测TCRP1对化疗药物5-Fu、cDDP的作用敏感性的影响并初步探讨其机制。结果肿瘤生长曲线及肿瘤瘤重结果显示TCRP1能增强裸鼠移植瘤对顺铂的耐药性,而对5-Fu则没有影响。TUNEL检测发现TCRP1高表达的组织中凋亡细胞计数更少。结论 TCRP1是一个新的耐药相关基因,其作用机制与通过增强口腔鳞癌细胞凋亡抗性有关。

TCRP1通过PI3k-Akt途径介导口腔鳞癌顺铂化学治疗耐受

目的:研究新的耐药相关基因TCRP1在口腔鳞癌组织中的表达及其与顺铂临床疗效的关系,同时对TCRP1的作用机制进行初步探索。方法:采用免疫组织化学法检测TCRP1在舌癌组织中的表达及其与临床顺铂化学治疗疗效之间及体外药敏实验的相关性,Western印迹法及免疫共沉淀甄别TCRP1下游的作用分子。结果:在TCRP1低表达的患者中,缓解率达84.62%,而高表达患者组中缓解率为37.5%。体外药敏结果显示类似的结果。TCRP1表达改变影响Akt信号通路分子的表达,而且TCRP1与Akt存在物理上的相互结合。结论:TCRP1的表达影响口腔鳞癌的顺铂化学治疗疗效。TCRP1介导顺铂耐药的作用机制至少部分与TCRP1对Akt信号通路调节有关。

C-myc上调TCRP1表达与舌癌细胞对顺铂耐受相关

我们先前曾报道了舌癌耐药相关蛋白1(tongue cancer-resistant protein 1,TCRP1)的cDNA克隆,及其在平阳霉素诱导的舌癌耐药细胞系Tca8113/PYM中高表达,而该细胞同时也对顺铂耐受,提示TCRP1可能参与舌癌细胞对顺铂的耐受,但是具体机制目前尚不清楚.本研究证明,TCRP1依赖c-myc的激活机制与舌癌细胞对顺铂耐受相关.生物信息学预测显示,TCRP1启动子存在原癌基因c-myc的结合位点;染色质免疫共沉淀(ChIP)技术证实,c-myc能通过其转录因子结合位点(transcription factor binding site,TFBS)与TCRP1启动子结合;利用半定量RT-PCR、蛋白质免疫印迹和MTS实验检测发现,将c-myc质粒导入舌癌细胞Tca8113中过表达,能显著上调TCRP1的mRNA和蛋白表达水平,且细胞对顺铂的耐受性增强;使用c-myc抑制剂或者siRNA沉默Tca8113/PYM细胞中c-myc,TCRP1的mRNA和蛋白表达水平均下降,且细胞对顺铂的敏感性增强.上述结果提示,转录因子c-myc可与TCRP1基因启动子特异性结合,上调TCRP1的表达,且该基因的表达上调与舌癌细胞对顺铂的耐受相关.

MDR1及TCRP1在人体口腔鳞癌中的表达与其耐药性的相关性

目的研究耐药基因MDRl（Multidrug resistance gene1）和TCRPl（tonguecancer resistance associated gene1）在人体口腔癌中与癌细胞耐药的相关性。方法随机收集40例口腔癌患者的癌组织，癌症类型均为鳞癌，对每一份癌组织均分为三份：一份用于原代培养进行药敏试验，然后使用MTT法检测细胞的增殖活性计算癌细胞的耐药指数；一份组织用于免疫组化检测MDRl和TCRPl蛋白表达；最后一份使用qRT—PCR定量检测MDRl和TCRPl基因表达的情况。结果分析癌细胞耐药指数与耐药基因之间的相关性发现两者之间存在正相关，其中MDRl与癌细胞耐药性相关系数为0.79（P〈0.01）；TCRPl与癌细胞耐药性相关系数为0.64（P〈0.01）；免疫组化结果示癌细胞耐药性越高MDRl和TCRPl蛋白表达量越多。结论耐药基因MDRl和TCRPl的高表达提高了口腔癌细胞的耐药性，增加了口腔癌的化疗难度。

利用CRISPR/Cas9技术构建人TCRP1基因敲除慢性髓系白血病K562细胞系及其生物学功能检测

目的选取人慢性髓系白血病(CML)细胞K562为实验对象,利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术构建稳定敲除舌癌耐药相关蛋白1(TCRP1)基因的CML细胞系K562/TCRP1-KO,通过细胞增殖、细胞凋亡、药物敏感性等功能试验比较K562/TCRP1-KO与对照细胞(K562/cas9-CTL)的表型差异,初步探讨TCRP1基因参与CML发病的可能机制。方法在特定位点设计针对TCRP1的小向导RNA(sgRNA),寡核苷酸片段退火后与线性化的Cas9表达载体重组,慢病毒包装系统转染293T细胞,收集纯化病毒感染K562细胞,嘌呤霉素加压筛选阳性多克隆,有限稀释法进一步筛选出单克隆K562/TCRP1-KO,Sanger测序和Western blot检测成功敲除的稳定细胞株,同时构建转染lentiCRISPR载体的K562细胞作为对照细胞株(K562/cas9-CTL),采用细胞计数法、CCK8法及伊马替尼(IM)梯度稀释法、流式细胞术分别对K562/TCRP1-KO和K562/cas9-CTL进行细胞增殖、药物敏感性及细胞凋亡分析。结果成功构建了用于TCRP1敲除的sgRNA-Cas9重组质粒载体,转染293T细胞后,利用有限稀释法成功筛选到TCRP1敲除的单克隆细胞株。与K562/cas9-CTL细胞相比,K562/TCRP1-KO细胞的增殖能力显著减弱,IM药物敏感性显著增强,细胞凋亡进程显著加快(均P<0.05)。结论利用CRISPR/Cas9成功构建了TCRP1敲除的CML细胞株,TCRP1可能作为癌症相关基因影响CML细胞的增殖、IM耐药能力及凋亡进程。