人质子感知受体TDAG8基因的克隆、表达载体构建及瞬时转染293T细胞

克隆了人质子感知受体TDAG8基因,构建了TDAG8基因的表达载体并瞬时转染293T细胞,检测了TDAG8的过表达。从人胃癌组织cDNA中克隆了TDAG8基因,亚克隆到pEASY-T1载体,通过测序、酶切、连接到表达载体pEGFP-N3,通过酶切、测序鉴定获得了pEGFP-N3-TDAG8重组质粒;表达载体以lipofectamine2000介导转染了293T细胞。Real time PCR法检测了外源基因在293T细胞中的表达。结果表明:克隆到了TDAG8基因并获得了pEGFP-N3-TDAG8表达载体,在293T细胞中检测到了表达过的TDAG8基因。

siRNA-pool抑制大鼠脊髓背角神经细胞TDAG8的表达

目的观察siRNA-pool对大鼠脊髓背角神经细胞(rat neurons-dorsal spinal cord cells,RNdsc)上T细胞死亡偶联基因8(T-cell death-associated gene 8,TDAG8)表达的影响。方法设计并合成针对TDAG8的siRNA 3对(siRNA63、siRNA341、siRNA897)及一条带绿色荧光标记的阴性对照siRNA。在阳离子聚合物纳米粒jetPEITM介导下转染RNdsc。RNdsc细胞随机分为正常(normal)组,载体(vehicle)组,阴性对照(mismatch)组,siRNA 50、100、200 pmol组。转染24 h后,荧光显微镜下计算转染复合物的转染效率,用MTT法检测转染复合物的细胞毒性,采用real-time PCR及Western blot测定siRNA-pool的干扰效率。结果采用jetPEITM作为转染介质转染效率高达98.9%。转染复合物的细胞毒性低,各组细胞成活率差异无统计学意义。siRNA 50、100、200 pmol可剂量依赖性地抑制TDAG8的表达,siRNA200 pmol组对TDAG8 mRNA表达的抑制率达88%,对TDAG8蛋白的表达抑制率达73%。结论 siRNA-pool能高效地抑制RNdsc上TDAG8的表达。

TDAG8通过AKT/mTOR参与胰腺癌疼痛作用的机制

目的探讨T细胞死亡相关基因8(TDAG8)通过AKT/mTOR参与胰腺癌疼痛作用的机制。方法将人胰腺癌细胞系SW 1990细胞移植到雌性BALB/c裸鼠胰腺中,建立胰腺癌致痛裸鼠模型。5周龄雌性BALB/C裸鼠48只随机分为假手术组(Sham组)、模型组(Model组)、NC-siRNA组、TDAG8-siRNA组,每组12只。Sham组注射培养基作为对照,NC-siRNA组及TDAG8-siRNA组分别将NC-siRNC、TDAG8-siRNA注射至胰腺癌痛模型裸鼠腹腔中。测量体重及苏木素伊红(HE)染色检测胰腺组织病理学变化。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测脊髓背角组织中TDAG8的表达;检测各组裸鼠驼背评分及腹部皮肤机械痛阈值;Western blotting检测脊髓背角组织中TDAG8、降钙素基因相关肽(CGRP)、P物质(SP)、丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)、p-AKT、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、p-mTOR蛋白水平。AKT通路抑制剂LY294002作用胰腺癌痛模型裸鼠,检测各组裸鼠驼背评分以及腹部皮肤机械痛阈值;Western blotting检测脊髓背角组织中CGRP、SP、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR蛋白水平。结果BALB/c裸鼠移植SW 1990细胞后,体重显著减轻,观察到胰腺癌细胞呈条索状排列密集,可见炎性细胞浸润,脊髓背角组织TDAG8 mRNA和蛋白水平显著升高,裸鼠驼背评分升高及机械痛阈值显著降低,脊髓背角组织CGRP、SP、p-AKT、p-mTOR蛋白水平显著升高(均P<0.05);TDAG8-siRNA和LY294002作用后裸鼠驼背评分降低及机械痛阈值均显著升高,脊髓背角组织CGRP、SP、p-AKT、p-mTOR蛋白水平显著降低(均P<0.05)。结论抑制TDAG8可减轻胰腺癌疼痛,其机制可能与抑制AKT/mTOR信号通路的激活有关。

TDAG8介导的细胞内信号传送通路及其功能

T细胞死亡相关基因8编码的受体蛋白/G蛋白偶联受体65(TDAG8)是G蛋白偶联受体家族成员之一,起初它被鉴定为脂质分子(鞘氨醇半乳糖苷)的受体;后来的研究证明TDAG8也具有感知细胞外的质子或pH的功能。因此,TDAG8是一种特殊的双配体受体。TDAG8受体广泛表达在免疫组织等正常组织和肿瘤组织中,具有潜在的重要生理作用。本文对TDAG8介导的细胞内信号通路及TDAG8功能研究进展进行综述。

乳酸及TDAG8在HPH中的作用

肺动脉高压(Pulmonary arterial hypertension,PAH)是静息时平均肺动脉压力持续升高至25mmHg以上,临床上最终导致右心衰竭。由慢性肺阻塞疾病、间质性肺病、睡眠呼吸障碍、肺泡低通气综合征、长期居住高原环境、肺发育不良等多种原因导致的缺氧,可触发肺循环系统的血管收缩反应,使肺循环阻力和肺动脉压持续升高,长期发展引起肺血管结构发生重构,称为低氧性肺动脉高压(Hypoxic pulmonary hypertension,HPH)。目前,HPH的发病机制尚未明确,但近年对于肺血管改变机制的研究仍为热点。因此,本文综述低氧导致乳酸(Lactic)的改变及微酸环境敏感的T细胞死亡偶联受体(T cell death coupling gene,TDAG8)在HPH中的作用。

质子敏感性OGR1亚家族及其研究进展

卵巢癌G蛋白偶联受体1（OGR1）亚家族是新近发现的一类对质子敏感的G蛋白偶联受体,它包括诱导细胞停滞于G2/M期的G蛋白偶联受体G2A（G2accumulation）、T细胞死亡偶联基因8（T-cell death-associatedgene8,TDAG8）、G蛋白偶联受体4（G protein-coupled receptor4,GPR4）及OGR1,它们相互之间具有40%~50%的序列同源性。一些脂质分子目前被认为是该类受体的配体,并且该类受体还能通过组氨酸残基感知胞外质子或pH值的变化。该亚家族可通过几种异源三聚体G蛋白包括Gs,Gi,Gq及G12/13介导细胞内多种信号通路,与肿瘤的发生、细胞骨架重组、免疫系统和血管系统功能等生理病理过程有关。