人睾丸特异表达基因TDRG1单克隆抗体的制备及鉴定

目的:构建原核质粒表达TDRG1重组蛋白,制备其单克隆抗体(mAb)并鉴定其生物学特性。方法:用逆转录聚合酶链反应法从成人睾丸组织中扩增TDRG1编码序列,将其克隆到pET21原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)内进行诱导表达TDRG1重组蛋白。以纯化后的重组蛋白免疫BALB/C小鼠,利用杂交瘤细胞融合技术制备单克隆抗体(mAb)。ELISA法检测杂交瘤细胞分泌mAb的效价和类型,Western印迹和免疫组织化学染色鉴定mAb的特异性。结果:成功构建了pET21/TDRG1原核表达质粒并获得纯度较高的重组蛋白。筛选出2株能稳定分泌抗TDRG1的单克隆抗体杂交瘤细胞系,其效价比高达1∶1.6×106,免疫球蛋白类型均为IgG1类。Western印迹和免疫组织化学染色显示该mAb能特异结合成人睾丸组织中的TDRG1蛋白。结论:所获得的重组TDRG1蛋白纯度高,免疫抗原性强,并成功制备了抗TDRG1的单克隆抗体。

组织芯片技术检测人睾丸基因TDRG1在睾丸肿瘤组织中的表达

目的:探讨人睾丸基因TDRG1在睾丸肿瘤组织中的蛋白表达及其病理学意义。方法:运用组织芯片技术、免疫组化法检测人睾丸特异基因TDRG1在睾丸肿瘤组织和正常睾丸组织中的表达。结果:15例正常人睾丸对照组中11例(73.3%)TDRG1蛋白表达为阳性;26例精原细胞瘤中7例(26.9%)TDRG1蛋白表达为阳性,7例畸胎瘤中4例(57.1%)TDRG1蛋白表达为阳性。而12例胚胎癌中10例(83.3%)TDRG1蛋白表达为阳性,10例卵黄囊瘤中8例(80.0%)TDRG1蛋白表达为阳性。精原细胞瘤实验组与正常人睾丸对照组相比较,两组间具有极显著性差异(P<0.01)。畸胎瘤实验组与正常人睾丸对照组相比较,两组间具有显著性差异(P<0.05)。而胚胎癌组和卵黄囊瘤组与正常人睾丸对照组相比较,没有显著性差异(P>0.05)。结论:TDRG1蛋白在精原细胞瘤和畸胎瘤的表达水平较正常对照睾丸组织显著降低,TDRG1可能为候选的抑癌基因。

人睾丸特异表达基因TDRG1 shRNA表达载体的构建及其表达

目的:构建人睾丸基因TDRG1的shRNA表达质粒,并研究其在NTERA-2细胞中的表达。方法:设计合成有短发夹结构靶位TDRG1基因的寡核苷酸,经退火成双链,克隆至载体pGPU6/GFP/Neo中,构建TDRG1shRNA表达载体,得到重组质粒TDRG1-shRNA486,TDRG1-shRNA738,TDRG1-shRNA921和一个阴性对照,使用Lipofectamine 2000转染shRNA至NTERA-2细胞,应用RT-PCR法检测转染后NTERA-2细胞TDRG1 mRNA的表达水平。结果:经测序证实,插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致。同时筛选到转染TDRG1-shRNA486的NTERA-2细胞TDRG1基因的mRNA表达水平明显抑制。结论:成功构建了人类睾丸基因TDRG1的shRNA表达载体,TDRG1-shRNA在NTERA-2细胞内成功表达。

长链非编码RNA-TDRG1高表达对宫颈癌临床进展及预后不良的影响

目的探讨长链非编码RNA睾丸发育相关基因1 (lncRNA-TDRG1)在宫颈癌组织中的表达特征及其与临床进展和预后的关系。方法采用荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)技术检测宫颈癌组织(60例)和相应毗邻正常宫颈组织(60例)中lncRNA-TDRG1的表达,比较不同年龄、FIGO分期、肿瘤细胞分化程度以及淋巴结转移患者宫颈组织中lncRNA-TDRG1的表达差异;并在4种不同类型宫颈癌细胞株(SiHa, HeLa, CaSki,C-33A)及正常宫颈细胞株Ect1/E6E7中验证其差异表达。卡方检验分析lncRNA-TDRG1表达水平与患者临床病理参数的关系。采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验绘制生存曲线,比较生存差异。同时,进行单因素和多因素Cox回归分析,分析生存数据。结果 lncRNA-TDRG1在宫颈癌组织、宫颈癌细胞株中均呈高表达。宫颈癌组织中lncRNA-TDRG1的表达和癌细胞分化程度(高中分化 vs 低分化,P=0.019),以及淋巴结转移情况(有vs无,P=0.037)有显著相关性。同时,宫颈癌患者高表达lncRNA-TDRG1时,表现出更差的总体生存预后(P<0.05)。单因素和多因素分析显示, lncRNA-TDRG1 高表达是宫颈癌患者预后不良的危险因素(P=0.006)。结论lncRNA-TDRG1在宫颈癌进展和预后中起十分重要的作用,可能作为宫颈癌患者预后的生物标志物。

LncRNA-TDRG1促进宫颈癌细胞恶性生物学行为的实验研究

目的探索长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)TDRG1促进宫颈癌患者临床恶性进展和不良预后的分子机制。方法收集宫颈癌细胞株、宫颈正常细胞株Ect1/E6E7,实时定量聚合酶链反应(quantitative real time-polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测TDRG1的表达水平。构建TDRG1-siRNA,转染宫颈癌细胞株,CCK-8、细胞平板克隆实验检测细胞增殖情况,Transwell实验检测细胞侵袭和迁移能力,流式细胞术检测细胞凋亡水平,Western blotting检测相关蛋白的表达。结果与正常宫颈细胞株Ect1/E6E7比较,宫颈癌细胞株中TDRG1的表达明显升高。下调Hela细胞中TDRG1表达会抑制细胞增殖、集落形成[(162±21)vs.(411±33),P<0.05]和侵袭、迁移能力[侵袭:(86±13)vs.(315±38),P<0.01。迁移:(177±22)vs.(406±41),P<0.01];同时,Hela细胞凋亡率增加[(28±1.5)%vs.(16±1.2)%,P<0.05],Bcl-2蛋白表达减少,Hela细胞自噬活性被抑制。结论 TDRG1可通过抑制宫颈癌细胞凋亡,增加细胞保护性自噬活性,促进其肿瘤恶性生物学进展。

睾丸特异性基因TDRG1在精原细胞瘤中的表达及临床意义

目的探讨睾丸特异性基因TDRG1在精原细胞瘤中的表达及临床意义。方法采用免疫组化的方法检测106例精原细胞瘤组织及35例正常睾丸组织中TDRG1的表达,首次对TDRG1与精原细胞瘤患者年龄及肿瘤TNM分期等临床病理参数的相关性进行分析。结果 TDRG1在精原细胞瘤组织中的表达明显高于正常睾丸组织,差异具有统计学意义。TDRG1的表达与TNM分期存在正相关性,与精原细胞瘤患者年龄无相关性。结论 TDRG1可能作为癌基因参与精原细胞瘤的发病,有望为精原细胞瘤提供新的研究思路及可能的治疗靶点。

人类睾丸基因TDRG1在不同物种间同源序列的克隆及分析

目的克隆人类睾丸特异基因TDRG1在不同物种间的同源序列,为研究该基因功能寻找动物模型。方法以人TDRG1基因全长序列作为查询序列,利用BLASTN软件检索小鼠、大鼠、黑猩猩和猕猴基因组数据库,查询到的同源序列运用RT-PCR实验验证。免疫组化染色初探TDRG1同源蛋白在不同物种间的表达。结果生物信息学分析表明小鼠和大鼠基因组中未检索到与TDRG1同源的序列,黑猩猩和猕猴基因组中分别有相似性为98%和90%的同源序列存在。RT-PCR验证了猕猴睾丸中的同源序列,免疫组化结果显示抗人TDRG1单克隆抗体能特异结合猕猴睾丸中的同源蛋白。RT-PCR和免疫组化染色也表明小鼠和大鼠睾丸中无同源序列和同源蛋白表达。结论 TDRG1基因在小鼠和大鼠睾丸中无同源基因表达,而在猕猴和黑猩猩睾丸中有同源基因表达,为今后建立动物模型提供了理论依据。

人睾丸基因TDRG1重组真核载体的构建及其表达

目的构建人睾丸基因TDRGl的真核表达质粒,并研究其表达。方法取人新鲜正常睾丸组织,提取总RNA,采用逆转录-聚合酶联链反应(RT-PCR)扩增TDRG1基因编码序列;将该基因克隆到真核表达载体pYD5中,构建真核细胞表达载体pYD5-TDRG1,用限制性内切酶酶切分析,DNA序列分析鉴定重组质粒;将测序正确的重组质粒pYD5-TDRG1在脂质体介导下转染293细胞,间接免疫荧光法和Western Blot法鉴定目的蛋白质的表达。结果 RT-PCR扩增出TDRG1基因编码序列,目的插入片段长约303bp;产物行限制性内切酶酶切后连接到真核表达载体pYD5,重组质粒pYD5-TDRG1经酶切及DNA测序鉴定构建成功;该质粒转染293细胞48h后在荧光显微镜下可观察到绿色荧光,阳性细胞率96.42%;行Western blot分析检测到约39.8kD的目的蛋白表达。结论成功构建了人类睾丸基因TDRG1的真核表达载体pYD5-TDRG1,TDRG1基因在293细胞内成功表达。

lncRNA TDRG1在调控心肌梗死诱导的心肌细胞凋亡过程中的作用研究

本研究的主要目的是探究lncRNA TDRG1在调控心肌梗死诱导的心肌细胞凋亡过程中的作用。方法 将大鼠随机分为三组:正常组、心肌梗死组、lncRNA TDRG1低表达组。通过结扎冠状动脉前降支血管的方式构建心肌梗死大鼠模型。通过腹腔注射lncRNA TDRG1 siRNA下调心肌梗死大鼠体内lncRNA TDRG1表达水平。通过荧光定量PCR检测心肌组织内lncRNA TDRG1表达水平;通过ELISA实验检测各组大鼠血清中肌酸激酶同工酶(CK-MB)和脑钠肽(BNP)表达水平;通过western blot实验检测各组大鼠心肌组织内凋亡相关蛋白表达水平。结果 与正常组相比,心肌梗死组大鼠血清中CK-MB和BNP表达水平显著增加,心肌组织内凋亡相关蛋白表达水平显著增加。与心肌梗死组相比,lncRNA TDRG1低表达组大鼠血清中CK-MB和BNP表达水平显著降低,心肌组织内凋亡相关蛋白表达水平显著降低。结论 lncRNA TDRG1可促进心肌梗死引起的心肌细胞凋亡。

穿膜肽-TDRGl重组蛋白原核表达载体的构建

构建穿膜肽TAT与TDRG1融合蛋白的原核表达载体。以p YD5-TDRG1载体为模板,设计N端和C端含有flag序列和不同酶切位点的引物,利用PCR技术扩增TDRG1基因片段。同时利用内切酶对已构建好的载体pET28aTAT-EGFP和pET28a-EGFP-TAT进行酶切处理,再把扩增产物插入已处理好的线性载体pET28a(含有TAT)中,构建成重组质粒pET28a-TAT-TDRG1和pET28a-TDRG1-TAT,热激转化到E.coli感受态细胞TOP10中,菌检PCR筛选,送测序比对验证。PCR扩增出TDRG1基因片段,目的插入片段长约344bp,产物行限制性内切酶酶切后连接到预先酶切处理好的线性载体pET28a上,并成功转化到E.coli感受态细胞TOP10中,菌检PCR筛选后挑选阳性克隆抽质粒送测序,测序比对序列完全一致。成功构建了原核表达载体pET28a-TAT-TDRG1和pET28a-TDRG1-TAT。

睾丸发育相关基因1在肿瘤中的效应和机制

长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是RNA分子中的一个新类型,它广泛参与肿瘤发生发展的过程。睾丸发育相关基因1(testis developmental related gene 1,TDRG1)作为一种长链非编码RNA,在诸多人类肿瘤中呈现异常表达并通过不同机制影响肿瘤增殖、侵袭转移且与患者的预后密切相关。本文对TDRG1在肿瘤中的生物学效应和分子机制进行综述。