香加皮乙酸乙酯提取物诱导人食管癌TE-13细胞凋亡的作用机制

目的:研究香加皮乙酸乙酯提取物(ethyl acetate extract fromCortex periplocae,CPEAE)诱导人食管癌细胞TE-13凋亡的作用机制。方法:采用MTT法分析CPEAE对TE-13细胞增殖的抑制作用;Giemsa染色法和透射电子显微镜下观察CPEAE处理后细胞凋亡形态的变化;FCM法检测CPEAE对细胞周期和凋亡率的影响;Western印迹法检测用药前后TE-13细胞中CDK4蛋白表达的变化。结果:CPEAE抑制TE-13细胞的增殖(P<0.05),并呈浓度及时间依赖性,作用48 h时的IC50值为(2.443±0.005)μg/mL;透射电子显微镜下观察发现,TE-13细胞发生了特征性的凋亡形态学改变;FCM检测可见典型的凋亡峰;CPEAE作用TE-13细胞后,CDK4基因表达水平降低。结论:CPEAE可诱导TE-13细胞发生凋亡,可能是通过下调CDK4基因表达水平而实现的。

反义寡核苷酸沉默乙酰肝素酶对食管鳞癌细胞株TE-13侵袭能力的影响

背景与目的:乙酰肝素酶(heparanase,Hpa)为降解硫酸乙酰肝素多糖的内糖苷酶,在多种恶性肿瘤的侵袭转移中发挥重要作用。本研究旨在探讨Hpa在食管鳞癌细胞株TE-13中的表达和转染Hpa反义寡核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotide,ASODN)对TE-13细胞的影响。方法:脂质体法转染人工合成的HpaASODN片段,应用RT-PCR、Westernblot和免疫细胞化学方法检测转染前后Hpa基因和蛋白表达的变化,Matrigel侵袭实验观察转染ASODN后TE-13细胞侵袭行为的改变。结果:在TE-13细胞中,RT-PCR扩增得到大小为585bp的Hpa基因条带,Westernblot检测到50ku大小的Hpa蛋白,免疫细胞化学染色表明Hpa主要定位于胞浆和胞膜。转染不同浓度HpaASODN后,RT-PCR、Westernblot和细胞免疫染色均证实TE-13细胞Hpa基因和蛋白表达下调,且随HpaASODN的浓度增高,基因和蛋白表达量逐渐降低(P<0.05),不同浓度HpaASODN组间有显著性差异(P<0.05)。Matrigel侵袭实验中,转染不同浓度HpaASODN后,侵袭至下室面的TE-13细胞数均下降(P<0.05)。随HpaASODN浓度的增高,侵袭至下室面的TE-13细胞个数逐渐减少(P<0.05),不同浓度HpaASODN组间有显著性差异(P<0.05)。结论:TE-13细胞存在Hpa基因的表达。HpaASODN能显著降低Hpa基因表达量,并且使TE-13细胞侵袭力明显下降。

香加皮水提取物诱导人食管癌细胞TE-13凋亡的实验研究

[目的]运用多种技术手段研究香加皮水提取物诱导人食管癌细胞TE-13凋亡。[方法]利用MTT染色在普通光镜下观察细胞凋亡形态学变化并观测药物对肿瘤细胞的抑制率;通过流式细胞仪分析人食管癌TE-13细胞凋亡率、细胞周期变化;DNA琼脂糖凝胶电泳方法检测肿瘤细胞凋亡的DNA水平变化;激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)检测细胞内钙离子浓度变化。[结果]经香加皮水提取物处理的人食管癌细胞TE-13出现核固缩、凋亡小体、新月状浓染区等细胞凋亡形态学改变,各剂量药物处理组的肿瘤细胞均表现生长抑制,且具有剂量依赖性,250μg/ml香加皮水提取物处理组的抑制率达91.02%。DNA琼脂糖凝胶电泳呈现典型的梯形电泳条带。药物处理组的肿瘤细胞更多地被阻止于G2/M期,各剂量组均出现明显的凋亡变化,最大凋亡率可达20.3%。各剂量药物处理组的肿瘤细胞内的Ca2+浓度明显高于对照组(P<0.01)。[结论]香加皮水提取物可明显抑制人食管癌细胞TE-13的生长增殖,诱导细胞凋亡,并能改变该肿瘤细胞周期分布,阻止细胞周期于G2/M期。

对羟基桂皮醛诱导食管癌TE-13细胞分化及其作用机制

目的:探讨木鳖子单体化合物对羟基桂皮醛(p-hydroxylcinnamaldehyde,CMSP)对食管癌细胞株TE-13的分化作用及其机制。方法:用流式细胞术检测质量浓度为10、20、40Dμg/ml的CMSP处理TE-13细胞对该细胞凋亡和细胞周期分布的影响,用吉姆萨染色、电镜观察TE-13细胞形态学改变,Real-time PCR和ELISA方法检测TE-13细胞中肿瘤相关抗原CEA和SCC的表达,用克隆集落形成实验、Transwell迁移实验检测不同质量浓度CMSP对TE-13细胞的增殖、迁移能力的影响,Western blotting检测CMSP(20μg/ml)对TE-13细胞中MAPK通路中各蛋白水平的影响。结果:CMSP可抑制食管癌Kyse30、TE-13、Eca109和Kyse180细胞的增殖[(1.6±0.2)×10~4 vs(3.8±0.3)×10~4、(1.7±0.3)×10~4 vs(4.5±0.4)×10~4、(2.5±0.1)×10~4 vs(4.0±0.4)×10~4、(1.5±0.1)×10~4vs(2.5±0.3)×10~4个细胞,均P<0.01],而对人食管上皮细胞无明显作用(P>0.05)。CMSP处理TE-13细胞后:(1)随CMSP质量浓度(10、20、40μg/ml)和处理时间的增加(24、48、72 h),G_0/G_1期细胞数量均增加、S期细胞数量减少(P<0.01或P<0.05),但细胞凋亡率无明显变化(P>0.05);(2)细胞出现典型分枝状突起,且随CMSP质量浓度增加更显著(P<0.05);(3)CEA和SCC水平显著降低(P<0.01);(4)抑制TE-13细胞的增殖和迁移能力,诱导细胞分化;(5)p-P38蛋白水平明显升高(P<0.01),而p-ERK、P-SPKA/JNK蛋白水平明显降低(P<0.01)。结论:CMSP抑制食管癌TE-13细胞的增殖、诱导其分化,其作用机制可能与上调MAPK信号通路中P-P38和下调P-ERK、P-SPKA/JNK有关。

PI-88对TE-13细胞及裸鼠移植瘤中乙酰肝素酶表达的影响

目的探讨硫酸化寡聚多糖(PI-88)对食管鳞癌细胞株TE-13乙酰肝素酶(Hpa)表达的影响,以及对裸鼠人食管癌移植瘤生长、血管生成及Hpa蛋白表达的影响。方法体外培养TE-13细胞,实验分为A组(对照组)、B组(15 mg/L PI-88干预组)和C组(30 mg/L PI-88干预组)。培养36 h后Western blot检测各组细胞Hpa蛋白表达。选取10只BALB/c/nu裸鼠,皮下接种TE-13细胞建立食管癌裸鼠移植瘤模型,建模成功后随机均分为观察组及对照组。观察组腹腔注射PI-88 40 mg/(kg·d),对照组给予等剂量生理盐水,连续注射14 d。每2 d测量移植瘤体积,注射第14天处死动物,剥除移植瘤行CD34染色,检测微血管密度(MVD)。Western blot及免疫组化染色检测Hpa蛋白表达。结果与A组相比,B、C组细胞Hpa蛋白表达量明显降低(P<0.001),且存在药物浓度依赖性。观察组裸鼠移植瘤体积、MVD值、Hpa蛋白表达水平及阳性细胞数均低于对照组(均P<0.05)。结论 PI-88可抑制TE-13细胞及食管癌裸鼠皮下移植瘤中Hpa表达,并抑制肿瘤生长和血管生成。

食管鳞状细胞癌TE-13细胞线粒体DNA及细胞凋亡检测

目的:检测人食管鳞状细胞癌TE-13细胞中线粒体DNA(mtDNA)与细胞凋亡的发生情况及可能的关系。方法:TE-13细胞分为2组:溴化乙啶(EB)处理组在细胞培养液中加入50mg/LEB,未处理组常规培养;在培养第4、8和12天分别利用半定量RT-PCR检测2组细胞mtDNA的表达,利用流式细胞术检测细胞的凋亡情况。结果:EB处理组的第4天和第8天mtDNA的表达量分别为(0.467±0.031)和(0.197±0.015),到第12天mtDNA已完全丢失,未处理组分别为(0.660±0.046)、(0.673±0.031)和(0.653±0.021),差异有统计学意义(F组间=1133.878,F时间=109.058,F交互=104.597;P<0.001)。流式细胞术检测结果显示,EB处理组凋亡细胞百分比高于未处理组(F组间=2773.035,F时间=407.652,F交互=406.641;P<0.001)。结论:抑制TE-13细胞中mtDNA的复制可能会促进细胞凋亡。

环状RNA circ-Foxo3模拟物转染对人食管癌细胞株TE-13增殖、凋亡、放射敏感性的影响

目的观察环状RNA circ-Foxo3模拟物(circ-Foxo3 mimics)对人食管鳞癌细胞株TE-13增殖、凋亡、放射敏感性的影响,并探讨其机制。方法体外培养人食管鳞癌细胞株TE-13,将circ-Foxo3 mimics和NC转染至TE-13细胞中培养(分别计为过表达组、NC组)。采用qRT-PCR法检测TE-13细胞circ-Foxo3,CCK8实验检测两组细胞OD值,流式细胞术检测两组细胞凋亡率,克隆形成实验检测两组细胞放射敏感性;Western blotting法检测两组细胞PTEN蛋白。结果 TE-13细胞转染前后circ-Foxo3相对表达量分别为0. 05±0. 01、3. 99±0. 17,转染前后比较,P<0. 05。过表达组0、24、48、72、96 h OD值分别为0. 20±0. 00、0. 32±0. 02、0. 46±0. 03、0. 74±0. 02、1. 26±0. 01,NC组分别为0. 20±0. 00、0. 45±0. 03、0. 72±0. 02、1. 35±0. 03、2. 18±0. 01,两组比较(除0 h外),P均<0. 05。过表达组照射前后细胞凋亡率分别为4. 83±0. 85、11. 67±0. 47,NC组分别为0. 37±0. 06、5. 17±0. 25,两组同组照射前后及两组治疗后比较,P均<0. 05。过表达组0、2、4、6、8 Gy细胞存活分数分别为0. 20±0. 00、0. 83±0. 04、0. 67±0. 01、0. 50±0. 03、0. 31±0. 01,NC组分别为0. 20±0. 00、0. 91±0. 02、0. 84±0. 01、0. 65±0. 02、0. 52±0. 02,两组比较(除0 Gy外),P均<0. 05。过表达组照射前后PTEN蛋白条带灰度值分别为0. 71±0. 02、0. 87±0. 01,NC组分别为0. 53±0. 04、0. 55±0. 04,两组同组照射前后及两组治疗后比较,P均<0. 05。结论 circ-Foxo3mimics转染能抑制细胞增殖,促进凋亡,增加了细胞对放射的敏感性,机制可能与circ-Foxo3上调PTEN蛋白表达有关。

连翘根醇提物体外诱导TE-13细胞凋亡的机制研究

目的:从基因及蛋白水平探讨连翘根醇提物(ethanol extract of Forsythia suspensa root,FSEER)诱导人食管癌TE-13细胞凋亡的作用机制。方法:不同质量浓度的FSEER(0.4、0.5和0.6mg/mL)作用于TE-13细胞24h后,采用FCM检测线粒体膜电位的变化;蛋白质印迹法检测细胞凋亡相关蛋白[caspase-3、caspase-8、caspase-9和细胞质中细胞色素C(cytochrome-C,Cyt-C)]经FSEER处理后在TE-13细胞中的表达情况;同时通过RT-PCR检测细胞凋亡相关基因Bax、Bad、Noxa、Bcl-2、Bcl-xl和Mcl-1mRNA的表达情况。结果:TE-13细胞经FSEER(0.4、0.5和0.6mg/mL)作用24h后,随FSEER作用浓度的升高,发生线粒体膜电位损伤的细胞数目逐渐增多,且明显多于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。蛋白质印迹法检测结果显示,经FSEER处理后,TE-13细胞中cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的表达水平及细胞质中Cyt-C的表达水平均逐渐增加,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);而caspase-8的表达水平则无明显变化,与对照组相比,差异无统计学意义。RT-PCR检测结果显示,FSEER可以上调TE-13细胞中Bax、Bad和NoxamRNA的表达水平,下调Bcl-2、Bcl-xl和Mcl-1mRNA的表达水平。结论:FSEER可能是通过依赖于线粒体的细胞凋亡内源途径而诱导人食管癌TE-13细胞发生凋亡的。

硫酸化寡聚糖PI-88对食管鳞癌细胞株TE-13增殖及侵袭作用的影响

目的探讨硫酸化寡聚多糖PI-88对食管鳞癌细胞株TE-13增殖和细胞侵袭行为的影响。方法培养中的TE-13细胞分为A组、B组和C组。A组用15μg·m L-1PI-88处理,B组用30μg·m L-1PI-88处理;C组用等体积0.9%氯化钠处理。用噻唑蓝(MTT)比色法检测0.5,1,2,4,8,16,32μg·m L-1PI-88对TE-13细胞增殖活性的影响。用Matrigel侵袭试验研究检测15或30μg·m L-1PI-88处理后对食管鳞癌细胞株TE-13细胞侵袭力的影响。结果 7个浓度组PI-88作用于TE-13细胞72 h,各组细胞存活抑制率差异无统计学意义(P>0.05)。Matrigel侵袭实验结果:A、B、C 3组侵袭细胞数差异有统计学意义(P<0.01),各组间比较差异均有统计学意义(A vs B,P<0.05;B vs C,P<0.01;A vs C,P<0.01)。结论 PI-88在一定浓度范围内对TE-13细胞生长无明显影响,但可抑制TE-13细胞侵袭能力,并且其抑制作用随剂量增大而增强。

miR-571靶向SLC1A5调控食管癌细胞TE-13的凋亡研究

[目的]探讨miR-571调控食管癌细胞凋亡的潜在分子机制。[方法]纳入2019年1月~2020年5月我院收治的食管癌患者60例,分析miR-571在其癌组织和癌旁组织中的表达情况。在食道癌细胞系Eca-109、NEC、TE-5、TE-10、TE-11、TE-13、KYSE-30、KYSE-150、KYSE-450、KYSE-510中过表达或敲低miR-571,分析其凋亡水平。通过miRDB在线分析和荧光素酶报告系统检测miR-571的底物。[结果]miR-571在食管癌组织中的表达水平低于癌旁组织(P<0.05)。在多种食管癌细胞中过表达miR-571后凋亡水平均有不同程度的上升(P<0.05);而敲低miR-571后凋亡水平均有不同程度的下降(P<0.05)。敲低SLC1A5时,食管癌细胞TE-13的凋亡水平上升(P<0.05)。过表达SLC1A5后,管癌细胞TE-13的凋亡水平下降(P<0.05)。在食管癌细胞TE-13中敲低miR-571后,SLC1A5的mRNA水平和蛋白水平上升(P<0.05);而过表达miR-571后,SLC1A5的mRNA水平和蛋白水平下降(P<0.05)。同时,荧光素酶报告实验发现miR-571靶向SLC1A5的3’端非编码区(P<0.05)。同时敲低miR-571和SLC1A5后,食管癌细胞TE-13的凋亡水平无明显变化(P<0.05)。同时过表达miR-571和SLC1A5后,食管癌细胞TE-13的凋亡水平无明显变化(P<0.05)。[结论]miR-571通过靶向SLC1A5 mRNA的3’端非编码区,降低SLC1A5的翻译水平,并促进了食管癌细胞TE-13的凋亡。

连翘叶乙醇提取物对人食管癌细胞增殖抑制作用的研究

目的研究中药连翘叶乙醇提取物体外对食管癌细胞增殖的影响及对TE-13细胞凋亡的影响并探讨其作用机制。方法应用MTT法分析不同浓度连翘叶乙醇提取物(ethanol extract of Forsythia sus-pense leaf,FSEE)对人食管癌细胞TE-13、TE-1、Yes-2和Eca-109增殖的影响;光学显微镜下观察经FSEE处理后细胞的形态学改变;Wright-Giemsa染色观察TE-13细胞凋亡的形态学变化;经Annexin V/PI双染后用流式细胞术检测FSEE对TE-13细胞凋亡率的影响;用不同浓度(0.1、0.2、0.5mg/ml)FSEE作用于TE-13细胞24 h后,分析细胞PARP、Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9蛋白表达的变化。RT-PCR法检测FSEE对TE-13细胞凋亡相关基因Bcl-2家族中Bcl-2、Bcl-xL、Bax mRNA表达的影响。结果 FSEE对人食管癌细胞增殖具有显著抑制作用(P<0.05);经FSEE处理24 h后,TE-13细胞出现明显的凋亡形态学改变,TE-13细胞凋亡率明显增高,与未处理组比较差异有统计学意义(P<0.01);经0.1、0.2、0.5 mg/mlFSEE作用24 h后,TE-13细胞PARP、Caspase 3、Caspase 9蛋白出现裂解片段,并随药物浓度增加,裂解片段浓度升高,呈浓度依赖性,组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。经FSEE处理后,TE-13细胞BaxmRNA表达上调,Bcl-2和Bcl-xLmRNA表达水平下调。结论 FSEE在体外可明显抑制食管癌细胞的增殖,诱导TE-13细胞凋亡,其机制可能与其通过Caspase依赖性的内源途径诱导细胞凋亡有关。

COX-2抑制剂(阿司匹林)体外抑制人食管癌细胞的生长及诱导凋亡

目的:探讨COX-2抑制剂阿司匹林对食管癌细胞作用的生物学效应及可能的作用机制。方法:采用MTT法检测阿司匹林对Eca-109和TE-13细胞生长的抑制作用;FCM法检测细胞凋亡及COX-2、bcl-2,Bax基因蛋白的表达;用RIA法检测培养上清中PGE_2的含量。结果:阿司匹林可抑制2种细胞的生长,并随药物浓度升高及作用时间延长抑制率逐渐增高,而使这2株细胞产生的PGE_2量明显降低。阿司匹林还能使2株细胞的G_0/G_1期细胞显著增多,S期细胞显著减少(P＜0．01),并引起了明显的细胞凋亡。2株细胞随阿司匹林作用时间的增加,COX-2和bcl-2表达显著减少,而Bax表达显著增高,COX-2、bcl-2和Bax的表达呈显著相关性(P＜0．01)。结论:阿司匹林能抑制食管癌细胞的增殖并可诱导其凋亡,对食管癌进行化学预防或辅助治疗具有可能性。

环氧化酶-2选择性抑制剂抑制人食管癌细胞的生长及其诱导凋亡

目的:探讨NS-398对食管癌细胞的生物学效应及可能的作用机制.方法:常规方法培养食管癌Eca-109和TE-13细胞,以不同浓度NS-398(5,10,20,40,80μmol/L)处理24,48,72h.采用四甲基唑蓝法(MTT)检测NS-398对Eca-109和TE-13细胞生长的抑制作用;流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡及COX-2,Bcl-2,Bax蛋白的表达;TUNEL法检测2种细胞凋亡情况;用放射免疫分析(RIA)检测培养液上清中前列腺素E2(PGE2)含量.结果:NS-398可抑制2种细胞的生长,并随药物浓度的增高及作用时间的延长抑制率逐渐增高,并使2种细胞产生的PGE2明显降低.NS-398使2种细胞G0/G1期细胞显著增多,S期细胞显著减少(Eca-109:F=22.39,P<0.01;TE-13:F=46.99,P<0.01),并引起了明显的细胞凋亡.NS-398使2种细胞COX-2和Bcl-2表达显著减少,而Bax表达显著增高.COX-2和Bcl-2的表达呈显著正相关(Eca-109:r=0.925,P<0.01;TE-13:r=0.925,P<0.01),COX-2和Bax表达呈显著负相关(Eca-109:r=-0.937,P<0.01;TE-13:r=-0.703,P<0.01)、Bax和bcl-2表达呈显著负相关(Eca-109:r=-0.926,P<0.01;TE-13:r=-0.753,P<0.01).结论:NS-398可抑制食管癌细胞的增殖并可诱导其凋亡,应用COX-2选择性抑制剂对食管癌进行化学预防或辅助治疗具有可能性.

胃肠道肿瘤TGF－α基因表达的研究

用分子杂交技术及流式细胞方法研究了转化生长因子α（ＴＧＦα）在人胃肠道肿瘤组织中的表达．结果表明，胃癌、结肠癌和直肠癌组织较相应癌旁组织ＴＧＦαｍＲＮＡ水平增高．佛波脂（ＴＰＡ１００μｇ／Ｌ）作用胃癌细胞ＭＧｃ８０－３后４ｈ，可使细胞中ＴＧＦαｍＲＮＡ水平增高，作用６ｈ可使Ｓ期细胞百分比明显增加．这些结果提示：ＴＧＦα在胃肠道肿瘤中起重要作用，其表达可受ＴＰＡ的调节．

p53基因对食管癌细胞的作用

目的 观察野生型p5 3基因对不同放射敏感性食管癌细胞的作用 ,探索p5 3基因治疗与放射治疗联合应用的价值。方法 以人食管癌细胞株TE 13及经反复照射后改变了放射敏感性的细胞TE 13R5 0为实验对象 ,将载有人野生型p5 3cDNA并含巨细胞病毒 (CMV)启动子的重组腺病毒(Ad5CMV p5 3)感染上述两种细胞及肿瘤组织并加用放射 ,在体、离体实验比较观察Ad5CMV p5 3对不同放射敏感性食管癌细胞的影响。结果 TE 13细胞及TE 13R5 0细胞的放射敏感性明显不同 (D0 值分别为 1.38、2 .4 8Gy) ;当联合应用Ad5CMV p5 3时明显增加了它们的放射敏感性 ,TE 13R5 0细胞的提高幅度较大 ,接近了亲代细胞的水平 (D0 值分别为 0 .97、1.14Gy)。放射合并瘤内注射Ad5CMV p5 3与单纯放射相比 ,荷瘤裸鼠的肿瘤生长速度明显受到抑制 ,对TE 13R5 0细胞的作用更大。结论 Ad5CMV p5 3可提高食管癌细胞的放射敏感性 ,在一定程度上消除了食管癌细胞的放射抗拒性。