shRNA转染对食管癌细胞TE13中CHK1和CHK2表达以及照射后G_2/M期阻滞的影响

背景与目的:肿瘤细胞照射后常表现为细胞周期的变化,本研究采用细胞周期监测点激酶CHK1和CHK2基因的短发卡状RNA(shRNA)转染食管癌细胞,观察对其蛋白表达以及60Coγ射线照射后细胞周期的影响。方法:设计合成并构建质粒连接的CHK1和CHK2 shRNA,分别提取质粒DNA并采用脂质体转染TE13细胞并传代;采用Westernblot、RT-PCR和流式细胞仪分别检测CHK1和CHK2蛋白和mRNA表达、以及5Gy60Coγ射线照射后细胞周期变化,克隆形成实验检测5Gyγ射线照射后细胞存活率。结果:采用CHK1和CHK2shRNA转染TE13细胞后,其mRNA和蛋白表达均明显降低。单纯5Gyγ射线照射后24h,TE13细胞G2/M期比例由未照射组的32.17%增至61.47%;shRNA转染的TE13细胞在5Gyγ射线照射后24h,G2/M期比例由单纯照射组的61.47%降至28.13%(CHK1)和42.80%(CHK2),P<0.05。5Gyγ射线、CHK1shRNA加5Gyγ射线、以及CHK2shRNA加5Gyγ射线照射后,细胞存活率分别为27.0%、13.0%和21.0%。shRNA转染的子一代TE13细胞在转染后120h,对CHK1和CHK2蛋白表达的抑制作用已基本消失;转染120h后以5Gyγ射线照射24h,CHK1或CHK2 shRNA转染组G2/M期比例高于单纯照射组,P<0.05;至转染后144h和5Gyγ射线照射后48h,转染组与单纯照射组比较G2/M期比例无明显差别,P>0.05。结论:采用质粒连接的人CHK1和CHK2 shRNA转染TE13细胞后,可以明显抑制其mRNA和蛋白表达并消除照射后G2/M期阻滞,增加放射敏感性;提示TE13细胞γ射线照射后G2/M期检测点可能受CHK1和CHK2激酶双重调节,但以CHK1为主。

蟾蜍灵抑制食管癌细胞增殖、迁移和趋化运动的机制研究

目的通过培养人食管癌TE13细胞株,观察蟾蜍灵对食管鳞状细胞癌细胞增殖、迁移、趋化运动及Raf-1、磷酸化Raf-1(p-Raf-1)表达的影响,阐明蟾蜍灵抑制食管癌转移的作用机制,为临床治疗提供实验依据。方法培养TE13细胞,通过MTT方法检测细胞药物毒性及对细胞增殖的影响,通过细胞划痕试验检测蟾蜍灵对迁移的抑制作用。通过Boyden小室实验检测蟾蜍灵处理后的食管癌细胞株TE13的趋化运动。采用免疫组织化学和Western blot检测蟾蜍灵处理后Raf-1、p-Raf-1蛋白的表达。结果 MTT结果显示,TE13细胞的增值抑制率随着蟾蜍灵浓度的增加(10、25、50、100和200 nmol/L)而升高(P<0.05)。划痕实验结果显示,不同溶度的蟾蜍灵处理TE13细胞后,TE13细胞的迁移能力随着蟾蜍灵浓度的增加而降低。Boyden小室实验结果显示,10、25、50和100 nmol/L蟾蜍灵处理后的食管癌细胞穿过滤膜细胞数量与对照组比较明显减少(P<0.05)。Western blot结果显示,各组Raf-1蛋白的表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。25、50和100 nmol/L蟾蜍组p-Raf-1的表达量与对照组比较明显减少(P<0.05)。免疫组织化学检测结果显示,各组Raf-1蛋白的表达差异无统计学意义(P>0.05)。25、50和100 nmol/L蟾蜍灵组的p-Raf-1阳性细胞数及棕黄色颗粒数与对照组比较明显减少(P<0.05)。结论当蟾蜍灵的药物浓度<200 nmol/L时,食管癌TE13细胞增殖的抑制作用不能通过其细胞毒性实现。蟾蜍灵对食管鳞状细胞癌TE13细胞株的迁移、趋化运动能力有明显的抑制作用。蟾蜍灵不抑制Raf-1蛋白表达,但可以降低p-Raf-1在食管鳞状细胞癌TE13细胞株的表达,提示可能通过抑制Raf-1的激活抑制ERK通路,从而抑制食管鳞状细胞癌TE13细胞株的转移。