酵母双杂交筛选TEB4相互作用蛋白

目的酵母双杂交筛选与TEB4(MARCH-Ⅵ)有相互作用的蛋白,构建该蛋白基因序列的重组载体。方法以人TEB4为诱饵质粒,利用酵母双杂交技术筛选人淋巴瘤cDNA文库。在SD/-4培养基上共获得150多个阳性克隆,将酵母菌扩增后抽提质粒,转化大肠杆菌,进行序列分析,并经过回复杂交验证,发现了一个与TEB4相互作用的蛋白:ATP synthase F0 subunit6(ATP-C6)。PCR法扩增ATP-C6,亚克隆到质粒pCMV-HA中,获得重组质粒pCMV-HA-ATP-C6,酶切和测序进行鉴定。结果从人淋巴瘤cDNA文库筛选到一个与TEB4有相互作用的蛋白ATP-C6,并成功构建重组质粒pCMV-HA-ATP-C6。结论应用酵母双杂交系统从人淋巴瘤cDNA文库中筛选并初步验证了与TEB4有相互作用的蛋白,为TEB4蛋白功能的进一步研究奠定了基础。

人膜相关蛋白TEB4的结构及其E3连接酶活性

TEB4(MARCH Ⅳ)是酵母Doa10的同源体,作为E3连接酶参与内质网相关蛋白的降解。TEB4和酵母Doa10定位于内质网上,包含一个环指域和多个跨膜域。这个环指结构位于蛋白的N端,具有特殊的C4HC3结构。在泛素结合酶UBC7参与的底物第48位赖氨酸特异点的泛素化反应中,分离开的环指域在细胞液中催化泛素的连接。这些特性与E3酶有关,E3酶是参与内质网相关蛋白降解的重要酶。和一些E3连接酶一样,TEB4可能参与神经退行性病变的调节。