斑马鱼tectb内耳基因敲除品系的构建及其作用机制

TECTB基因编码的β-盖膜蛋白(β-tectorin)在人类听觉功能中具有重要的调控作用,是内耳器官中覆盖膜的重要组成成分,在声音转导为神经信号的过程中发挥着关键作用。β-tectorin突变会导致人类非综合征性耳聋的发生,而目前关于听觉障碍发生的分子机制仍然有待研究。斑马鱼(Danio rerio)是一种常用的试验动物模型,能够对内耳发育和相关疾病的研究提供重要的价值。为了研究tectb基因在斑马鱼内耳发育中的作用,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,成功构建tectb内耳基因缺失型斑马鱼模型,并对tectb基因缺失的斑马鱼表型进行初步分析。首先,在tectb基因的第三号外显子上设计靶位点以及基因型检测引物,经体外扩增得到向导DNA(sgDNA),再对其进行体外转录,得到向导RNA(sgRNA);然后,将sgRNA与Cas9酶通过显微注射的方式注射到野生型斑马鱼胚胎中,经基因型鉴定筛选出携带突变的嵌合体F0代鱼,培养至性成熟后与野生型斑马鱼杂交得到F1代突变体杂合子;在遗传稳定性鉴定及基因序列测序之后,保留突变类型为移码突变的F1代鱼,培养至成年后,经过自交得到F2代tectb突变体纯合子;最后,通过体式显微镜初步观察及毛细胞染色试验,发现突变体斑马鱼内耳组织结构正常,耳石形态和大小没有明显差异,毛细胞的发育也没有明显缺陷,但是体内器官与组织的发育是否发生变化,需要进行深入研究。这项研究为深入了解内耳发育的分子机制和耳聋等人类疾病提供了有价值的研究模型,借助tectb基因敲除斑马鱼模型,我们可以探究该基因在疾病发生中的具体作用,更好地研究内耳发育中的关键途径,有利于进一步深入研究听力的调控机制。

人类TECTB基因的电子克隆

用小鼠和鸡的 β tectorin基因 (Tectb)的编码区序列对NCBI数据库进行Blastn比较 ,得到一个相似性很高的人的gDNA序列 (GenBank :AL15 7786 ) ,用GENSCAN、MZEF程序和Blast2sequence程序分析AL15 7786 ,推测AL15 7786中包含一个编码区由 10个外显子构成的基因———TECTB基因。人TECTB基因的开放阅读框为 990bp ,推测编码32 9个氨基酸。人TECTB基因与小鼠的Tectb基因在 990bp有 88 1%的一致性 ,在 32 9个氨基酸有 94 2 %的一致性。用Electronic PCR将人TECTB基因定位于 10q2 5。

对一个新的耳聋候选基因-TECTB的初步研究

目的 通过对作为 β tectorin编码的基因TECTB进行结构分析并探讨它与耳聋发生的关系 ,以鉴定其是否为新的耳聋基因。方法 2 7个语前聋家系病人用直接测序的方法进行突变检测 ;40个语后聋家系则用PCR SSCP进行突变检测 ,对发现异常构象带者进一步行TECTB基因的DNA测序。结果 2 7个语前聋家系病人发现三种核酸改变 ,但通过对这种改变的家系进一步检测时证实这些改变均未与耳聋共分离 ,为正常多态。 40个语后聋家系先证者用SSCP进行突变检测 ,未发现致病突变。结论 本研究的结果虽未能最终证明TECTB为耳聋的致病基因 ,但从该基因背景来分析它仍是很好的耳聋候选基因 。