TEM型β-内酰胺酶动力学研究

利用分光光度法研究 3种由革兰氏阴性菌产生的 TEM型 β-内酰胺酶的动力学。以 L- B作图法求取 Km 和 Vmax。TEM- 1、TEM- 2对青霉素类有较强水解作用 ,对第一代头孢菌素和第三代头孢菌素头孢哌酮也有一定程度水解 ,而对第二代头孢菌素头孢呋新及其它第三代头孢菌素均无水解作用 ;而 TEM- 5对青霉素类及第一、二、三代头孢菌素均有不同程度的水解 ;TEM型酶的最适 p H值为 6 .6～ 7.4,最适反应温度为35℃～ 40℃。不同 TEM型酶其水解底物轮廓有较大差异 ,温度、p

TEM型β-内酰胺酶

随着β-内酰胺类抗生素在医学和兽医学临床的广泛使用,革兰阴性菌对该类抗生素的耐药性不断增加,其中最主要的耐药机制之一是产生β-内酰胺酶。TEM型酶是目前数量最多的一群β-内酰胺酶,包括广谱酶TEM-1、TEM-2和TEM型超广谱β-内酰胺酶等,其中大多数属于超广谱β-内酰胺酶。论文就TEM型β-内酰胺酶的出现与流行、分子生物学特征、耐药机制、检测方法和防控策略的研究进展进行了综述。

TEM型β-内酰胺酶的研究进展

TEM型是目前数量最多的一群β-内酰胺酶，迄今已发现155种，少数属于广谱p内酰胺酶，大多数属于超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）。TEM型ESBLs的特点是对青霉素类和氧亚氨基头孢菌素耐药，对碳青霉烯类和7-α-甲氧基头孢菌素敏感，可被β-内酰胺酶抑制剂抑制。但有一些TEM型酶对酶抑制剂抵抗，称之为耐酶抑制剂β-内酰胺酶（IRT），不属于ESBLs；特别是已发现TEM-50、-68、-89、-109、-121、-125型酶不仅具有ESBLs的耐药特征，而且具有IRT的特征，这种复杂的TEM变异体（CMT）的出现，不仅对实验室检测ESBLs是一个挑战，而且也给临床治疗带来困难。

对比黏液型肺克超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)表达和毒力基因分布的相关性并对其耐药性进行分析

目的分析黏液型肺克(MT-KPN)的超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)表达、耐药性、毒力基因分布情况。方法收集郑州市第一人民医院2021年3月至2022年3月非重复性KPN 725株,黏液丝试验分离出123株MT-KPN,对其ESBLs表达、耐药性使用CITEK 2 Compact系统分析,毒力基因分布情况使用聚合酶链式反应(PCR)实验分析。结果肺炎克雷伯菌(KPN)检出率最高的科室是重症医学科;同一科室检出KPN类型差异较大的是重症医学科、全科医学科、神经外科,肾内科只检出cKPN;123株MT-KPN包括ESBLs阳性菌34株、ESBLs阴性菌89株。ESBLs阳性菌耐药性高达100.00%的7种药物(头孢呋辛、头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、头孢西丁、氨曲南、阿莫西林/克拉维酸),ESBLs阴性菌对上述药物耐药性显著低于ESBLs阳性菌(P<0.05);妥布霉素、亚胺培南、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦耐药性ESBLs阳性菌>ESBLs阴性菌(P<0.05);庆大霉素、美罗培南、环丙沙星、左氧氟沙星耐药性ESBLs阳性菌>ESBLs阴性菌(P>0.05);MT-KPN的荚膜血清型基因检出率wzyK2最高;荚膜血清型基因检出率ESBLs阳性菌、ESBLs阴性菌相比差异无统计学意义(P>0.05);MT-KPN毒力基因检出率最高的是mrkD;aerobactin、iroN、wcaG检出率相比ESBLs阳性菌<ESBLs阴性菌(P<0.05);其他毒力基因检出率ESBLs阳性菌、ESBLs阴性菌相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论MT-KPN携带毒力基因检出率较高,临床需结合其耐药性和毒力基因分布情况合理用药。

鸡大肠杆菌TEM和CTX-M型超广谱β-内酰胺酶基因分型研究

【目的】检测鸡大肠杆菌超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的基因型和基因亚型,了解河南省产酶鸡大肠杆菌ESBLs基因型分布。【方法】对河南省7个地区不同鸡场临床分离28株产ESBLs鸡大肠杆菌分别用TEM、SHV和CTX-M等3种通用引物进行PCR扩增及测序分析,确定其基因型和基因亚型。【结果】21株鸡大肠杆菌检出TEM型基因,2株检出CTX-M型基因,5株检出TEM型和CTX-M型两种基因,未检出SHV型。TEM基因亚型以TEM-1变异型为主,与AY293072(TEM-1)相比同源性为98%—99%,核苷酸序列除发生18T→C沉默突变外,尚有3株分别有另一处碱基发生变化:783G→A(C3菌,序列号为FJ405207)、21T→A(X2菌,序列号为FJ405208)和269G→A(F4菌,序列号为FJ405211),其中前两处为沉默突变,F4菌的碱基突变引起92甘氨酸变为天冬氨酸,为TEM-57型。CTX-M基因亚型包括两种:CTX-M-65亚型4株(C2、C3、C4和K1,序列号分别为FJ405191,FJ405192,FJ405212和FJ405214)和CTX-M-14亚型3株(F2、X3和B5,其中F2菌的相关序列已上传至GenBank,获序列号为FJ405213)。【结论】目前河南省产ESBL鸡大肠杆菌基因亚型以TEM-1变异型为主,CTX-M-65和CTX-M-14型次之。

合肥市产超广谱β-内酰胺酶菌株TEM型耐药基因分布

目的 了解 1999～ 2 0 0 0年合肥市多所医院临床分离的产超广谱 β 内酰胺酶 (ESBLs)肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中 ,TEM型 β 内酰胺酶基因型分布。方法 酶抑制剂增强的肉汤稀释法筛选出产ESBLs细菌 ,PCR扩增其TEM型 β 内酰胺酶编码基因片段 ,克隆入pGEM Teasy载体 ,双脱氧链终止法测定核苷酸序列并确定TEM基因型。结果 98株产ESBLs菌株中有 79株产TEM型 β 内酰胺酶 ,其中TEM 1型 75株和TEM 10型 4株。结论 合肥市产ESBLs肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中存在 2种TEM型 β 内酰胺酶 ,在国内首次报道一种新的 β 内酰胺酶(TEM 10 )。

TEM型β内酰胺酶新亚型TEM-166编码基因的克隆表达

目的了解临床分离大肠埃希菌Ayfy2926中TEM型β内酰胺酶的基因型。方法采用聚合酶链反应(PCR)扩增大肠埃希菌Ayfy2926中TEM型β内酰胺酶的全编码基因并对PCR产物进行序列分析;PCR产物克隆入pHSG398质粒并在感受态细胞大肠埃希菌JM109中进行表达,琼脂稀释法测定转化子菌株对β内酰胺类抗菌药的敏感性。结果大肠埃希菌Ayfy2926中TEM型β内酰胺酶的基因型为一种新亚型,TEM-166(GenBank注册号FJ197316);与TEM-1相比,仅有1个氨基酸差异(Arg120→Gly);与TEM-1转化子菌株相同,TEM-166转化子菌株对哌拉西林高度耐药,对第三代头孢菌素、亚胺培南敏感,β内酰胺酶抑制剂可显著降低克隆表达菌株的耐药性。结论TEM-166为TEM型β内酰胺酶的新亚型,是一种非超广谱β内酰胺酶。

一种新基因型TEM-128β-内酰胺酶的发现及其临床意义

目的 分析产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)鲍曼不动杆菌TEM型β-内酰胺酶(BLA)的编码基因并确定其亚型。方法 采用聚合酶链反应(PCR)扩增BLA编码基因TEM、SHV、OXA、CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-9、PER和VEB片段,双脱氧链终止法测定核苷酸序列、确定亚型。结果 临床分离的鲍曼不动杆茵HZ38株产生TEM型BLA,其扩增片段含1 049个核苷酸,核苷酸及相应的氨基酸序列经Gen-Bank查询无相同序列,为新发现的一种BLA TEM-128型(GenBank注册号:AY359287)。结论 临床分离的鲍曼不动杆菌HZ38株所产BLA为TEM-128亚型,为一种新发现的新型BLA。

耐头孢他啶阴沟肠杆菌TEM-28V β-内酰胺酶的特性研究

目的研究耐头孢他啶阴沟肠杆菌TEM-28Vβ-内酰胺酶的特性。方法用KB纸片扩散法和等电聚焦(IEF)对细菌β-内酰胺酶类型进行初步判断;碱裂解法提取质粒并进行PCR扩增测序;饱和硫酸铵反抽提,并经SephadexG-75凝胶过滤和DE-52阴离子交换层析法纯化β-内酰胺酶;SDS-PAGE法测定分子量和紫外分光光度法测定酶动力学参数。结果6株临床分离菌均对头孢他啶耐药。IEF显示,每株菌产生一种或两种β-内酰胺酶,等电点(pI)分别为5.5、5.6和8.7。根据基因分析推测,pI为5.6的酶的氨基酸序列与TEM-2同源性为100%。pI为5.5的酶与TEM-28比较存在4个氨基酸突变,其分子量为28.77ku;酶动力学分析证实,TEM-28V能水解头孢他啶、头孢噻肟和氨曲南,不能水解亚胺培南,对舒巴坦和三唑巴坦的IC50分别为107和220nmol/L。结论TEM-28V可能为TEM-28变异型超广谱β-内酰胺酶。

运用变性高效液相色谱快速检测TEM型产超广谱β-内酰胺酶菌株

目的建立一种快速检测TEM型产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)临床分离菌及其流行病学监测的新方法。方法采用PCR技术从临床分离株中扩增出TEM型质粒的编码序列,扩增产物用变性高效液相色谱(DHPLC)技术进行分析并进行DNA测序,确定其基因突变的类型,最后通过比对确定其基因型。结果共检测66株临床分离菌,其中42株扩增出TEM型基因。经过DHPLC分析,35株表现为单一的洗脱峰,其形态与TEM-1标准菌株的峰型相一致,测序确定它们的碱基序列亦相一致,不存在变异,为TEM-1型;5株表现为一种异常的洗脱峰,它们均为双峰,形态一致,测序结果表明它们均存在两种相同的基因突变,经比对后确定为TEM-10型;另外2株表现为另一种异常的洗脱峰,测序结果显示为TEM-116型。结论 DHPLC技术可用于细菌耐药基因的分型检测,不但灵敏度和特异度高,而且具有经济、快捷、高通量等特点,具有很大的潜在临床应用价值。

牛奶中TEM1型β-内酰胺酶免疫胶体金试纸条的研制

牛奶中存在的抗生素残留是影响牛奶安全的重要因素之一,其来源主要是奶牛养殖过程中使用的β-内酰胺类抗生素,如青霉素簇药物。近来出现了一种声称能分解抗生素的＂抗生素分解剂＂-TEM1型β-内酰胺酶。该酶能将青霉素类药物降解。

同时产CTX-M-22及TEM-1型β-内酰胺酶的阴沟肠杆菌耐药性分析

目的了解临床分离阴沟肠杆菌株EC003产β-内酰胺酶的耐药特征和基因型。方法采用琼脂二倍稀释法对阴沟肠杆菌EC003进行MIC检测,酶提取物三维实验检测AmpC酶,双纸片法筛选及确证实验检测超广谱β-内酰胺酶(ESBLs),等电聚焦(IEF)电泳测定其等电点。以耐药质粒为模板进行PCR扩增,将β-内酰胺酶全编码基因克隆、表达,并对其扩增产物进行DNA序列测定和同源性分析。结果阴沟肠杆菌株EC003对所试多数β-内酰胺类抗生素耐药,表型检测AmpC酶为阴性,ESBLs阳性,IEF显示该菌产两种pI分别为8.7及5.4的β-内酰胺酶。PCR扩增产物DNA测序证实为CTX-M-22、TEM-1型β-内酰胺酶全编码基因,产TEM-1的克隆菌株仅对青霉素类耐药,产CTX-M-22的克隆菌株对所试多数β-内酰胺类抗生素耐药,对头孢噻肟的水解程度明显强于头孢他啶。结论临床分离阴沟肠杆菌株EC003同时产CTX-M-22和TEM-1型两种β-内酰胺酶,可导致对多数β-内酰胺类抗生素耐药。

鲍曼不动杆菌启动子突变TEM-1型β-内酰胺酶基因研究

目的 分析浙江湖州地区临床分离的鲍曼不动杆菌β-内酰胺酶(BLA)耐药基因序列，并确定其亚型。方法 采用微量稀释法对在2001年1月至2002年12月间自临床分离的39株鲍曼不动杆菌进行药敏试验、三维试验检测ESBLs，采用聚合酶链反应(PCR)技术检测TEM、SHV、OXA、CTX-M、PER及VEB型BLA耐药基因，并对7株TEM基因型阳性的分离株(编号分别为HZ08、HZ09、HZ17、HZ24、HZ35、HZ37、HZ40)进行耐药基因序列分析。结果 39株鲍曼不动杆菌TEM型BLA耐药基因PCR扩增均呈阳性，其余基因PCR扩增均为阴性。7株TEM基因测序结果表明他们的基因片段全长均含1022个核苷酸，经GenBank网上同源性比较，发现这些序列与广谱酶TEM-1(GenBank注册号：AF188200)的编码区域序列相同，但在启动子区域-47位点处均有1个核苷酸发生突变(G→T)。其中HZ40株的TEM-1序列已在GenBank核酸数据库中成功注册(GenBank注册号：AY263331)。HZ08、HZ09、HZ24、HZ35、HZ37和HZ40株ESBLs均阳性，HZ17株ESBLs阴性。结论 临床分离的鲍曼不动杆菌携带伴启动子区域核苷酸突变的TEM-1亚型BLA耐药基因，此基因可以导致ESBLs表型阳性。

产超广谱β-内酰胺酶菌表型和TEM基因型配对检测的研究

对临床分离的 13株产超广谱 β-内酰胺酶菌进行表型和TEM基因型配对检测的研究。结果发现该 13株菌对氨苄西林、头孢噻吩、头孢唑啉、头孢呋新均表现为耐药 ;部分菌对头孢他啶、头孢噻肟和氨基糖苷类、环丙沙星表现为耐药。但该 13株菌对亚胺培南均表现为敏感。 13株菌经TEM基因套式PCR检测均呈阳性 ,表明该 13株菌至少存在TEM型质粒。该

TEM-1型β-内酰胺酶编码基因的克隆表达

目的:构建TEM-l型β-内酰胺酶基因的表达载体。方法:通过PCR扩增TEM-l全编码基因,将其连接入pBK-CMV载体中,并在大肠杆菌JM109中表达。采用琼脂二倍稀释法对TEM-l克隆菌株进行MIC检测,双纸片法筛选及确证实验检测其表型,等电聚焦(IEF)电泳测定其等电点(pIs)。结果:经酶切测序鉴定TEM-l基因的表达载体构建正确。重组菌产pI为5.4的TEM-l广谱酶,仅对青霉素类耐药。结论:TEM-l基因原核表达载体正确构建,为进一步研究打下了基础。

广州地区革兰阴性杆菌CTX-M和OXA型广谱β-内酰胺酶基因分型研究

目的调查广州地区临床分离的革兰阴性杆菌中CTX-M型超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)和OXA型广谱β-内酰胺酶(beta-lactamase,Bla)的主要基因型别及其流行情况。方法按照NCCLS 2001年标准筛选广州地区临床分离菌株的ESBLs表型;用聚合酶链反应(PCR)扩增法和DNA测序法进行ESBLs基因序列分析。结果PCR扩增结果显示,CTX-M1、CTX-M2、CTX-M9群和OXA的总阳性率在本地区临床分离的临床检测ESBLs阳性的革兰阴性杆菌中分别为9.96%、0、35.5%和1.6%,同时检出≥两种ESBLs基因的菌株数64株,阳性率为5.9%;序列分析进一步证实了CTX-M型ESBLs的具体型别,包括CTX-M-3、CTX-M-22、CTX-M-9、CTX-M-14、CTX-M-17、CTX-M-18、CTX-M-21、CTX-M-24、TOHO-2和TOHO-3,其比例分别为3.23%、3.7%、4.99%、3.32%、2.21%、3.69%、2.95%、4.43%、1.85%和1.48%;其中以CTX-M-9和CTX-M-24阳性率较高;在本地区只检出1种OXA型Bla-OXA-2/PSE-2(1.38%,15/1084);另外,还检出了8株无法具体归类的CTX-M-9型ESBLs,占0.74%;CTX-M型基因主要分布于大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中,分别占42.8%和36.3%,而OXA基因则主要分布于铜绿假单胞菌中,占80%。结论本地区CTX-M类ESBLs也较为常见,其中尤以CTX-M-9和CTX-M-24为主,暂无CTX-M2群ESBLs,可能存在1种或多种新的CTX-M型ESBLs。

产超广谱β-内酰胺酶表型及基因型分布

目的 了解淮北地区 3 所医院,临床分离产超广谱β 内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中ESBLs表型和基因分布。方法 用1999年NCCLS推荐的初筛试验,从 147 株大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中筛选出可疑产ESBLs细菌,并用确证试验加以确认,然后用 PCR的方法扩增其基因型。结果 116 株大肠埃希菌和31株肺炎克雷伯菌中,共检出69株产ESBLs(46 9%),其中大肠埃希菌 51 株(42 2%),肺炎克雷伯菌 18 株(58 1%);将初筛得到的可疑菌株用纸片扩散确证法,头孢噻肟和头孢噻肟/克拉维酸测定,检出 69 株产 ESBLs细菌,而用头孢他啶和头孢他啶/克拉维酸检测ESBLs阳性菌为32株;PCR扩增基因型阳性结果为TEM型 119株、SHV型10株、CTX M型68株、OXA型 18 株。结论 淮北地区 ESBLs的检出率为 46 9%,头孢噻肟检测ESBLs的敏感性明显高于头孢他啶;基因型以CTX M型为主,有些菌株同时携带≥2种耐药基因。

大肠埃希菌与肺炎克雷伯菌超广谱β-内酰胺酶基因型研究

目的了解医院产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的基因型和耐药性。方法收集产ESBLs的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的临床菌株30株,应用PCR基因扩增技术及DNA测序方法,分别对其TEM、SHV、CTX-M、VEB、PER编码基因进行分析。结果在30株菌株中有26株为CTX-M型,占86.67%;其中CTX-M-9型共计16株占61.5%,CTX-M-1型8株占30.8%,CTX-M-2型7株占26.9%;同时产CTX-M-1型及CTX-M-2型共4株占15.4%,产CTX-M-2型及CTX-M-9型1株占3.8%,产CTX-M-1型及CTX-M-9型1株占3.8%。结论产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的主要临床流行基因型是CTX-M-9型。

鲍曼不动杆菌ADC型AmpC β-内酰胺酶基因研究

目的了解浙江湖州解放军第98医院自临床分离的鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）中ADC型AmpC β-内酰胺酶基因（blaADC）存在状况。方法收集2000年7月-2002年12月所分离到的60株鲍曼不动杆菌，采用聚合酶链反应及序列分析的方法分析blaADC基因。结果60株中有59株blaADC基因呈阳性（98．3％），序列分析表明4号菌株（原始编号HZB3944）blaADC基因为-新亚型，其核酸序列已登录GenBank（注册号EF569589）。结论鲍曼不动杆菌中blaADC基因阳性率很高，产ADC型AmpC β-内酰胺酶是本组菌株对β-内酰胺类抗生素耐药的重要原因之一。

合肥市产超广谱β-内酰胺酶菌株CTX-M型耐药基因的初步分布

目的 了解 1999～ 2 0 0 0年合肥市多所医院临床分离的产超广谱 β-内酰胺酶 (ESBL s)肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中 CTX- M-型耐药基因的初步分布情况。方法 根据 Gen Bank的基本序列 (CTX- M- 1、CTX- M- 9和CTX- M- 8)而设计 3对引物 ,分别用这些引物对表型确认试验证实产 ESBL s的细菌进行 PCR扩增。结果 98株产 ESBL s细菌中 ,5 6株产 CTX- M-型 β-内酰胺酶 ,其中 CTX- M- 1、CTX- M- 9和 CTX- M- 8来源的分别为 30、2 9和 0株。结论 合肥市有产 CTX- M-型