TEM-1β内酰胺酶介导的大肠埃希菌对哌拉西林-他唑巴坦和头孢哌酮耐药机制的研究

目的探讨临床分离大肠埃希菌RJ904对阿莫西林-克拉维酸、哌拉西林-他唑巴坦等含β内酰胺酶抑制剂抗菌药物和头孢哌酮耐药,而对头孢西丁、头孢噻肟敏感的机制。方法通过三相水解试验了解大肠埃希菌RJ904所产酶的水解特性;以大肠埃希菌J53Azr为受体菌,临床菌株RJ904为供体菌,通过接合试验了解该耐药特性是否由质粒介导;通过"鸟枪法"随机克隆试验将耐药质粒经BamHI和HindⅢ双酶切后的片段插入到克隆载体pACYC184中表达并测序,明确介导该耐药特性的基因;通过重叠延伸法定点突变及亚克隆了解启动子对耐药基因表达的影响。结果菌株RJ904中的酶可水解哌拉西林-他唑巴坦、头孢哌酮,但不水解头孢西丁、头孢噻肟,而且其耐药性可通过质粒接合转移。耐药质粒经BamHI和HindⅢ酶切后重组到载体pACYC184中的3.9 kb双酶切片段,含有大小861 bp的blaTEM-1B基因,其上游的启动子为Pa/Pb。该重组载体表达后对头孢哌酮、哌拉西林-他唑巴坦等含酶抑制剂抗菌药物耐药,而对头孢西丁、头孢噻肟敏感,重组载体中blaTEM-1B基因启动子经32位的T→C定点突变后,由强启动子Pa/Pb变为弱启动子P3,突变后的重组质粒转化入大肠埃希菌DH5α后所表达的耐药性与突变前相比MIC值均有较大下降。结论本试验首次证实在大肠埃希菌中Pa/Pb启动子调控TEM-1β内酰胺酶的高表达可使细菌对阿莫西林-克拉维酸、哌拉西林-他唑巴坦等含酶抑制剂抗菌药物和头孢哌酮耐药,而且这种耐药基因位于转座子和质粒上,可通过接合转移扩散。

同时产PER-1型和TEM-1型β内酰胺酶铜绿假单胞菌的检出

目的 分析多重耐药铜绿假单胞菌临床株 (编号 0 10 7)对 β内酰胺类抗生素耐药情况及其原因。 方法 用改良三维试验分析 0 10 7株产生的 β内酰胺酶表型 ,以碱裂解法提取质粒 ,用聚合酶链反应 (PCR)方法扩增质粒的酶基因型别 ,并对阳性产物测序。结果 0 10 7号铜绿假单胞菌临床株产生超广谱 β内酰胺酶 (ESBLs) ,携有blaPER - 1基因 ,同时还有blaTEM - 1型基因。结论 0 10 7号菌株耐 β内酰胺类抗生素耐药的可能原因是产生PER - 1型的ESBLs和TEM - 1型的广谱酶。

产TEM-116型β-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌耐药性研究

目的通过比较分析产TEM-116型β-内酰胺酶(-βlactamases)的肺炎克雷伯菌临床耐药性,了解TEM-116型β-内酰胺酶的特性。方法采用纸片扩散法进行细菌药敏试验,并以分析性等电聚焦的方法测定其等电点(isoelectric points,PI),对产TEM-116肺炎克雷伯菌与产TEM-1肺炎克雷伯菌的耐药性进行研究。结果产TEM-1和产TEM-116的肺炎克雷伯菌均对AMP 100%耐药,对第一、二代头孢菌素高度耐药,对第四代头孢菌素FEP敏感,对IPM 100%敏感;而产TEM-116肺炎克雷伯菌对AMC、TZP、AMK、GEN的耐药率较产TEM-1型者高,卡方检验显示二者之间差异存在显著性(P<0.05);分析性等电聚焦显示,TEM-116型β-内酰胺酶PI值为5.4,绝大多数产TEM-116肺炎克雷伯菌有>2条电泳带,仅1株只产TEM-116,它对大多数抗菌药物耐药。结论产TEM-116的肺炎克雷伯菌,对抗菌药物的耐受率比产TEM-1的肺炎克雷伯菌显著升高,排除其他耐药质粒的影响,TEM-116对β-内酰胺的水解能力明显高于TEM-1,具备了ESBLs的特性。

TEM型β内酰胺酶新亚型TEM-166编码基因的克隆表达

目的了解临床分离大肠埃希菌Ayfy2926中TEM型β内酰胺酶的基因型。方法采用聚合酶链反应(PCR)扩增大肠埃希菌Ayfy2926中TEM型β内酰胺酶的全编码基因并对PCR产物进行序列分析;PCR产物克隆入pHSG398质粒并在感受态细胞大肠埃希菌JM109中进行表达,琼脂稀释法测定转化子菌株对β内酰胺类抗菌药的敏感性。结果大肠埃希菌Ayfy2926中TEM型β内酰胺酶的基因型为一种新亚型,TEM-166(GenBank注册号FJ197316);与TEM-1相比,仅有1个氨基酸差异(Arg120→Gly);与TEM-1转化子菌株相同,TEM-166转化子菌株对哌拉西林高度耐药,对第三代头孢菌素、亚胺培南敏感,β内酰胺酶抑制剂可显著降低克隆表达菌株的耐药性。结论TEM-166为TEM型β内酰胺酶的新亚型,是一种非超广谱β内酰胺酶。

鸡福氏志贺菌产超广谱β-内酰胺酶SHV-12和TEM-1V基因的重组表达及酶特性

通过PCR扩增获得鸡福氏志贺菌产超广谱β-内酰胺酶SHV-12和TEM-1V型ESBLs基因片段,定向克隆入质粒载体构建重组质粒,酶切和DNA测序鉴定后转化受体菌BL21,用SDS-PAGE电泳观察目的基因在重组菌中的表达,用双紫外分光光度仪测定表达蛋白的底物水解特性和抑制剂的抑酶作用。结果表明,构建的重组质粒经EcoRⅠ和XholⅠ双酶切后,可切下目的条带;DNA测序发现插入片段与SHV-12和TEM-1V ESBLs基因序列完全一致。重组质粒转化BL21所表达的重组蛋白有超广谱β-内酰胺酶活性。重组菌S-BL21、T-BL21的最优表达条件分别是IPTG浓度0.5、0.8mmol/L,诱导温度37℃、37℃,诱导时间5、4h。SHV-12和TEM-1V型ESBLs能水解青霉素G、氨苄西林、阿莫西林、头孢噻呋、头孢曲松和头孢噻肟;对头孢噻呋钠的Km值最小,分别为4.9和1.29;对头孢曲松钠的Km值最大,分别为53.43和24.13;抑制剂舒巴坦钠、它唑巴坦钠对SHV-12和TEM-1V型ESBLs水解抗生素有不同程度的抑制作用。

鲍曼不动杆菌启动子突变TEM-1型β-内酰胺酶基因研究

目的 分析浙江湖州地区临床分离的鲍曼不动杆菌β-内酰胺酶(BLA)耐药基因序列，并确定其亚型。方法 采用微量稀释法对在2001年1月至2002年12月间自临床分离的39株鲍曼不动杆菌进行药敏试验、三维试验检测ESBLs，采用聚合酶链反应(PCR)技术检测TEM、SHV、OXA、CTX-M、PER及VEB型BLA耐药基因，并对7株TEM基因型阳性的分离株(编号分别为HZ08、HZ09、HZ17、HZ24、HZ35、HZ37、HZ40)进行耐药基因序列分析。结果 39株鲍曼不动杆菌TEM型BLA耐药基因PCR扩增均呈阳性，其余基因PCR扩增均为阴性。7株TEM基因测序结果表明他们的基因片段全长均含1022个核苷酸，经GenBank网上同源性比较，发现这些序列与广谱酶TEM-1(GenBank注册号：AF188200)的编码区域序列相同，但在启动子区域-47位点处均有1个核苷酸发生突变(G→T)。其中HZ40株的TEM-1序列已在GenBank核酸数据库中成功注册(GenBank注册号：AY263331)。HZ08、HZ09、HZ24、HZ35、HZ37和HZ40株ESBLs均阳性，HZ17株ESBLs阴性。结论 临床分离的鲍曼不动杆菌携带伴启动子区域核苷酸突变的TEM-1亚型BLA耐药基因，此基因可以导致ESBLs表型阳性。

用DNA杂交技术检测产β-内酰胺酶的临床分离菌株的TEM-1基因

为了探求院内感染革兰氏阴性杆菌产生超广谱β内酰胺酶的基因决定机制，我们采用ＤＮＡ斑点杂交技术对所选临床分离的产β内酰胺的大肠埃希氏菌、克雷伯氏菌等进行了其质粒介导的β内酰胺酶基因类型分析。对２０株菌质粒用ＴＥＭ１探针检测的结果如下：１１株大肠埃希氏菌全与ＴＥＭ１探针杂交；６株肺炎克雷伯氏菌有３株与ＴＥＭ１探针杂交；１株已证明含有ＳＨＶ２超广谱β内酰胺酶的日勾维肠杆菌未与ＴＥＭ１探针杂交；２株不动杆菌有１株（溶血不动杆菌）与ＴＥＭ１探针杂交。

TEM-1型β-内酰胺酶编码基因的克隆表达

目的:构建TEM-l型β-内酰胺酶基因的表达载体。方法:通过PCR扩增TEM-l全编码基因,将其连接入pBK-CMV载体中,并在大肠杆菌JM109中表达。采用琼脂二倍稀释法对TEM-l克隆菌株进行MIC检测,双纸片法筛选及确证实验检测其表型,等电聚焦(IEF)电泳测定其等电点(pIs)。结果:经酶切测序鉴定TEM-l基因的表达载体构建正确。重组菌产pI为5.4的TEM-l广谱酶,仅对青霉素类耐药。结论:TEM-l基因原核表达载体正确构建,为进一步研究打下了基础。

TEM-1型β内酰胺酶的原核表达纯化及活性验证

目的:产β-内酰胺酶是大肠杆菌、肺炎克雷伯菌等对β内酰胺类抗生素耐药的主要机制之一,该酶能水解青霉素、头孢菌素、碳青酶烯类等多种抗生素,其中TEM型是发现最早且种类最多的β内酰胺酶。探讨TEM-1型β内酰胺酶原核表达载体的构建、酶的纯化及活性验证。方法:利用PCR技术,以大肠杆菌全基因组为模板钓取TEM-1基因,构建p ET22b(+)-TEM-1表达质粒,经测序鉴定后,转入大肠杆菌Transetta(DE3),IPTG诱导表达、亲和纯化,并通过抗生素水解实验验证其酶活性。结果:构建了可溶性表达TEM-1的工程菌,通过亲和纯化最终获得纯度达90%以上的TEM-1型β内酰胺酶,该酶可水解氨苄西林。结论:获得了对氨苄西林具有水解活性的TEM-1型β内酰胺酶,并对其进行了酶动力学参数检测,验证其抗生素水解特性,有利于对临床抗生素的合理应用做出指导。

TEM-1型β-内酰胺酶及CarO蛋白介导的耐舒巴坦鲍曼不动杆菌临床株耐药机制研究

目的研究TEM-1型β-内酰胺酶及Car O蛋白介导的鲍曼不动杆菌临床株对舒巴坦的耐药机制。方法将24株非重复鲍曼不动杆菌临床株通过琼脂稀释法分为舒巴坦非敏感组(18株)和敏感组(6株),用纸片扩散法(K-B)行药敏试验,PCR扩增bla_(TEM-1)和car O基因,选取4株bla_(TEM-1)阳性菌株(A3、A5、1327、C1),对其扩增产物测序,BLAST软件分析;应用实时荧光定量RT-PCR技术检测2组菌株bla_(TEM-1)和car O基因m RNA转录情况。结果敏感组临床株对美罗培南、亚胺培南、头孢哌酮、环丙沙星、庆大霉素、氨苄西林耐药率分别为1/6、2/6、3/6、1/6、5/6、5/6;非敏感组分别为6/18、10/18、18/18、18/18、18/18。敏感组未检出bla_(TEM-1),非敏感组中16株临床株扩增出bla_(TEM-1);24株临床菌株全部扩增出car O基因。测序显示4株临床株bla_(TEM-1)基因均未出现有义突变;A3、A5、1327启动序列为P4,C1为P3。BlaTEM-1基因阳性菌株m RNA相对表达量与其对舒巴坦MIC值呈正相关(rs=0.551,P=0.027);car O基因m RNA相对表达在敏感组和非敏感组中无差异。结论临床分离鲍曼不动杆菌受试菌株耐药严重,其对舒巴坦的耐药机制与TEM-1型β-内酰胺酶高表达有关,而bla_(TEM-1)基因启动子调控可能是TEM-1型β-内酰胺酶高表达的原因之一。

臭鼻克雷伯和鲍曼不动杆菌中检出NDM-1型金属β内酰胺酶基因

目的调查对碳青霉烯类抗菌剂敏感性降低的肠杆菌和鲍曼不动杆菌中NDM-1型金属β内酰胺酶基因的存在情况。方法应用改良Hodge试验和EDTA协同试验对2007～2010年本院收集的对碳青霉烯类抗菌剂敏感性降低的肠杆菌和鲍曼不动杆菌进行碳青霉烯酶筛选。PCR法扩增NDM-1基因,并对PCR扩增阳性产物进行DNA测序分析。对NDM-1基因阳性菌株用PCR方法检测armA和rmtB16S rRNA甲基化酶基因,VIM、SPM、IMP和KPC碳青霉烯酶基因以及Ⅰ类整合子。Etests法进行药敏试验。结果 70株肠杆菌中10株Hodge Test和EDTA协同试验阳性,55株鲍曼不动杆菌中6株EDTA协同试验阳性。其中1株臭鼻克雷伯和3株鲍曼不动杆菌PCR扩增出NDM-1型金属β内酰胺酶基因目的片段,经测序比对为NDM-1型基因。其中1株臭鼻克雷伯和1株鲍曼不动杆菌检测出armA型16S rRNA甲基化酶基因,1株鲍曼不动杆菌检测出2000 bp左右的Ⅰ类整合子,未检出除NDM-1型外的其他碳青霉烯酶基因。NDM-1基因阳性菌除对替加环素、多黏菌素B敏感外,对其他检测的抗菌剂均耐药。结论臭鼻克雷伯和鲍曼不动杆菌中存在NDM-1型金属β内酰胺酶基因,有的携带armA型16S rRNA甲基化酶基因和Ⅰ类整合子,为该地区首次报道。

PER-1型超广谱β内酰胺酶在革兰阴性杆菌中的流行情况调查

目的:了解PER-1型超广谱β内酰胺酶(ESBLs)在革兰阴性杆菌中的流行情况。方法:采用纸片扩散试验初筛和确证ESBLs表型,用聚合酶链反应(PCR)扩增耐药基因及PCR产物测序验证PER-1型ESBLs。结果:ESBLs的总检出率27.3％(179/656),PER-1型占ESBLs的8.9％(16/179),产酶菌以鲍曼不动杆菌为主。结论:应加强对PER-1型ESBLs的检测,以有效控制由产生该型ESBLs细菌引起的医院感染。

非O1、非O139型霍乱弧菌中首次发现PER-1超广谱β内酰胺酶

目的明确非O1、非O139型霍乱弧菌中ESBL的基因型及其遗传背景,以探讨该耐药基因传播的机制。方法通过表型确证试验确定细菌是否产生ESBL,通过接合试验了解ESBL是否由质粒介导,通过PCR扩增和序列分析确定ESBL的基因型,通过反向PCR和序列分析了解ESBL基因两侧的结构。结果 ESBL表型确证试验确认菌株RJ354为产ESBL菌株,接合试验证实ESBL基因位于可接合质粒上,PCR、反向PCR扩增和序列分析确定其基因型为blaPER-1,该基因上游序列为ORF513,下游为gst-like基因。结论本研究国际上首次在从非O1、非O139型霍乱弧菌中检出了PER-1型ESBL,而且首次发现该酶基因与一种新的基因元件ISCR1相连,后者可能介导前者的水平转移。

铜绿假单胞菌超广谱β-内酰胺酶编码基因OXA-1表达产物的纯化及复性分析

目的纯化、复性铜绿假单胞菌携带的OXA-1基因产物并分析其生物学活性。方法用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导OXA-1基因表达,超声处理法裂解包涵体,经低浓度尿素复性、透析纯化,将经过复性、纯化的蛋白加于水解酪蛋白(Mueller-Hinton,MH)琼脂平板药敏纸片上判断蛋白活性。结果OXA-1编码基因产物有β-内酰胺酶活性。结论获得OXA-1活性蛋白,为进一步研究应用奠定基础。

大肠埃希菌产PER-1型超广谱β-内酰胺酶的研究

目的检测大肠埃希菌产PER-1型超广谱β-内酰胺酶的发生率及其耐药特点。方法采用双纸片增效确证试验进行超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的表型检测,对表型阳性菌株用聚合酶链反应(PCR)和PCR产物测序方法确定超广谱β-内酰胺酶的基因型。结果167株大肠埃希菌中有50株产ESBLs,占29.9%(50/167);6株产PER-1型ESBLs,占3.6%(6/167)。6株产PER-1型ESBLs大肠埃希菌均对头孢他啶和头孢噻肟耐药,5株对头孢西丁耐药,4株对阿米卡星敏感,全部菌株对亚胺培南敏感。结论大肠埃希菌中检测到产PER-1型超广谱β-内酰胺酶,且其耐药和多重耐药性严重,应引起重视。

海南2株大肠埃希菌中发现新德里金属β-内酰胺酶1

目的分离和确认2株耐碳青霉烯类药物大肠埃希菌(E.coli)携带新德里金属β-内酰胺酶1(NDM-1)基因。方法用法国生物梅里埃公司API20E生化鉴定条和Vitek 2全自动细菌鉴定仪和配套GNS卡鉴定出2株耐亚胺培南和美罗培南的E.coli;并对其进行亚胺培南/亚胺培南+EDTA纸片法协同试验、IP/IPI E-test试条法协同试验检测金属β-内酰胺酶,对目的菌株进行NDM-1基因PCR特异性扩增,扩增产物测序鉴定;对目的菌株进行质粒接合转移试验分析其耐药机制。结果 2株测试菌亚胺培南/亚胺培南+EDTA纸片法协同试验、IP/IPI E-test试纸条法协同试验均为阳性,PCR扩增及测序证实为携带NDM-1耐药基因;体外药敏试验除对多黏菌素B和替加环素敏感外,其他广谱抗菌药物包括头孢菌素类、β-内酰胺类加酶抑制剂类、碳青霉烯类、氨基糖苷类和喹诺酮类均呈现高水平耐药,2株接合子E.coli对所有β-内酰胺类药物的MIC值高于受体菌E.coli J53,其中对美罗培南和亚胺培南MIC均提高了8倍以上,头孢他啶及头孢曲松则提高了64倍以上。结论海南地区出现携带NDM-1基因的E.coli,该基因可在不同菌株之间传递。

新发现的获得性金属β-内酰胺酶GIM-1和SIM-1

金属β-内酰胺酶(简称金属酶,MBL),水解底物广泛,但相对其他β-内酰胺酶是研究较少的一类酶。由于碳青霉烯类抗生素的广泛应用,使一些沉默的金属酶被激活,产酶菌株增多,一些新的金属酶基因不断被发现,尤其是由整合子介导的金属酶基因的存在使得临床治疗失败。将从新的金属酶基因的发现与传播、酶动力学参数及分子生物学特点等几方面,对新发现的获得性金属酶GIM-1和SIM-1作一综述。

北京地区携带OXA-1型超广谱-内酰胺酶志贺菌耐药特点研究

目的了解本地区志贺菌中携带OXA-1型超广谱β-内酰胺酶(exteneded spectrum beta-lactamases,ESBLs)耐药基因型及耐药特征。方法收集2008至2011年分离出的志贺菌83株,聚合酶链反应(PCR)检测OXA-1型耐药基因,阳性产物序列在GenBank上比对确定基因亚型;对携带OXA-1型耐药基因菌株按照Kirby-Bauer法进行药物敏感性试验,测定志贺菌对8种头孢类抗生素耐药情况。结果 83株志贺菌中,21株携带OXA-1型ESBLs基因,阳性率为28.57%,其中21株福氏志贺菌检出15株,61株宋内志贺菌检出6株。阳性产物均为OXA-1亚型。药敏结果显示,携带OXA-1型基因菌株对头孢噻吩、头孢唑林等头孢类抗生素耐药,对头孢西丁、头孢他啶、头孢吡肟和头孢哌酮等头孢类抗生素均敏感。结论本地区志贺菌中以携带OXA-1亚型ESBLs耐药基因为主,在福氏志贺菌中检出高于宋内志贺菌,该基因与志贺菌对头孢类抗生素的耐药性呈一定相关性。

一株同时产OXA-23型碳青霉烯水解酶和PER-1型超广谱β-内酰胺酶的鲍曼不动杆菌

目的 分析多重耐药鲍曼不动杆菌对 β 内酰胺耐药的原因及其耐药基因的转移方式。 方法 用等电聚焦电泳试验和三维试验分析多重耐药鲍曼不动杆菌临床菌株所产 β 内酰胺酶 ,并进行初步分类 ,用聚合酶链反应 (PCR)扩增和产物测序方法确认 β 内酰胺酶基因 ,用PCR扩增整合子全可变区和质粒接合实验来判定其耐药基因的转移方式。结果 该临床菌株产超广谱 β 内酰胺酶 ,经分子生物学方法证实有blaPER 1基因 ,同时还有blaOXA 2 3 基因和aacA4基因。结论 发现一株产OXA 2 3型碳青霉烯酶和可转移的PER 1型超广谱 β 内酰胺酶的鲍曼不动杆菌 ,blaPER

牛奶中TEM1型β-内酰胺酶免疫胶体金试纸条的研制

牛奶中存在的抗生素残留是影响牛奶安全的重要因素之一,其来源主要是奶牛养殖过程中使用的β-内酰胺类抗生素,如青霉素簇药物。近来出现了一种声称能分解抗生素的＂抗生素分解剂＂-TEM1型β-内酰胺酶。该酶能将青霉素类药物降解。