DNA双加氧酶TET家族蛋白1抑制上皮性卵巢癌转移的作用机制研究

目的探讨TET家族蛋白1(TET1)在调控上皮性卵巢癌(EOC)转移中的作用机制。方法在EOC细胞系中瞬时转染TET1过表达质粒,通过Transwell实验检测EOC细胞迁移能力变化。通过蛋白质免疫印迹检测上皮细胞黏附分子(EpCAM)的表达。通过蛋白质免疫荧光实验检测EpCAM上游转录因子β-连环蛋白的亚细胞定位变化。检测β-连环蛋白的上游抑制因子叉头框基因O4(FOXO4)基因启动子区5hmC和5mC含量变化。通过染色质免疫共沉淀实验检测TET1与FOXO4基因启动子区域结合情况。利用EOC组织芯片对TET1与β-连环蛋白进行免疫组织化学染色,探讨二者表达的相关性。结果过表达TET1明显抑制EOC细胞系OVSAHO和JHOS4的细胞迁移能力,且明显抑制EpCAM的表达。TET1过表达后促进β-连环蛋白的亚细胞定位发生变化,其核内聚集明显减少,β-连环蛋白与EpCAM基因启动子区域结合亦明显减少。TET1过表达可以促进FOXO4的表达,进而抑制β-连环蛋白进入细胞核发挥转录因子作用。当FOXO4表达被敲低后,β-连环蛋白的细胞核内分布明显增加。在浆液性卵巢腺癌组织样本中,71.8%(28/39)TET1表达呈阳性,15.4%(6/39)β-连环蛋白表达呈阳性,TET1与β-连环蛋白的表达呈负相关(χ^(2)=4.745,P=0.030)。结论TET1通过调控FOXO4/β-连环蛋白/EpCAM轴抑制EOC转移。

寻常型银屑病患者皮损组织中DNA去甲基化酶TET3过表达介导转录因子KLF4显著高表达

目的 探讨银屑病患者皮损组织中Krüppel样因子4(Krüppel-like factor 4, KLF)异常高表达的DNA甲基化分子机制。方法 以20例寻常型银屑病患者病理检查所取皮损组织为实验组,13例眼外伤手术患者所取眼睑皮肤组织为对照组。采用亚硫酸氢盐测序(bisulfite sequencing, BSP)检测各组皮肤样本及转染十-十一转位3(ten-eleven translocation 3, TET3)过表达及干扰质粒的人永生化角质形成细胞HaCat中转录因子Krüppel样因子4(Krüppel-like factor 4, KLF4)启动子区DNA甲基化水平,RT-qPCR和Western blotting检测各组皮肤组织样本及转染HaCat细胞中KLF4、TET1(ten-eleven translocation1)、TET2、TET3的表达水平。结果 实验组KLF4启动子DNA甲基化水平显著低于对照组(P<0.01),实验组KLF4的mRNA表达水平显著高于对照组(P<0.01)。实验组KLF4启动子DNA甲基化水平与mRNA表达水平呈显著负相关(r=-0.649,P=0.002)。实验组TET3表达水平显著高于对照组(P<0.01), TET1及TET2表达水平差异无统计学意义。实验组TET3表达水平与KLF4启动子DNA甲基化水平呈显著负相关(r=-0.688,P=0.001)。HaCat细胞中过表达TET3后,KLF4启动子DNA甲基化水平明显下调(P<0.01),KLF4表达水平显著上调(P<0.01)。HaCat细胞中干扰TET3表达后,KLF4启动子DNA甲基化水平明显上调(P<0.01),KLF4表达水平显著下调(P<0.01)。结论 过度表达的TET3通过下调KLF4启动子DNA甲基化水平,介导银屑病患者皮损组织中KLF4过度表达。

阐明TET家族蛋白质底物偏好性机制

基因组中胞嘧啶的甲基化修饰是重要的表观遗传标记,其动态变化参与了多种重要生物学过程。TET(ten-eleven translocation)家族蛋白质介导了5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5m C)的连续氧化,相继生成5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5hm C)、5-醛基胞嘧啶(5-formylcytosine,5f C)和5-羧基胞嘧啶(5-carboxylcytosine,5ca C)三种产物。生化实验结果表明,虽然TET2可以连续催化5m C、5hm C和5f C的氧化,但其对不同底物的催化效率具有明显差异,针对5m C的催化效率最高,而针对5f C的最低。这一特性可能对维持基因组甲基化状态稳定具有重要意义。然而,生化与结构生物学实验均显示,TET2对不同底物结合与识别能力无明显差异。分子模拟与QM/MM计算结果表明,整个反应循环中的第三步(氢抽提)为限速步骤,且能垒趋势与实验观测反应效率一致,并预测氢抽提反应的能垒差异主要来源于不同底物在反应中间体时取向不同。进一步的同位素动力学效应实验确证了氢抽提步骤为整个反应的限速步骤,并且停留光谱实验证实,TET2对不同底物催化效率的差异来源于氢抽提步骤反应速率的不同。我们的研究首次阐明了TET2底物偏好性源于底物碱基5-位取代基自身的性质,并且证实5hm C修饰由于不易于被TET2继续氧化而可在基因组中保持稳定。这对深入理解基因组去甲基化修饰的分子机制及对TET2及其家族蛋白小分子调控剂的研发具有重要意义。

TET家族蛋白与肺部疾病研究进展

DNA甲基化是表观遗传调控中研究最早、最重要的一种修饰方式,关键基因的DNA甲基化特征性改变与疾病的发生发展密切相关。近期研究结果显示,生物体内存在的DNA去甲基化酶——TET家族蛋白,能通过多种途径催化5-甲基胞嘧啶(5-mC),去甲基化为5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC),从而调控DNA甲基化平衡。TET蛋白生物功能的发现为表观遗传学研究开辟了全新的领域,本文综述了TET家族蛋白在肺癌、肺结核、支气管哮喘、慢性阻塞性肺病等多种肺部疾病发生发展中的作用。

TETs蛋白在乌拉坦诱导小鼠肺癌模型中的表达模式

目的探讨TET家族蛋白在小鼠肺癌模型中的表达模式。方法将小鼠分成3组,每组10只。分别设为对照组(Con),乌拉坦诱导组(Ure),以及羟基脲给药组(Ure-HU)。对Ure组和Ure-HU组连续10周给予800 mg/kg乌拉坦溶液,诱导建立小鼠肺癌摸型。10周后对Ure-HU组给予HU药物(500 mg/kg),连续21 d。观察肺部形态结节个数。利用q PCR和Western blot分析TETs在3组小鼠中的表达模式。结果与Con组相比,Ure和Ure-HU组体重下降明显。形态学观察显示,Ure组和Ure-HU组均有肺组织病变。q PCR结果显示,在Ure组,TETs表达显著降低(P<0.05)。经过HU处理后,Ure-HU组TET1和TET2表达上升(P<0.05)。Western blot与q PCR结果一致。结论在乌拉坦诱导的小鼠肺癌模型中,TETs蛋白表达模式异常,证明在肺癌发生过程中,TET1和TET2具有重要作用。

5hmC及其Tet 氧合酶在小鼠视网膜成熟过程中的调控

目的:通过两个不同年龄段的小鼠视网膜组织来探究小鼠视网膜成熟过程中5hmC表达的稳定性及Tet氧合酶的调控情况。方法:选取2周龄及2月龄健康雄性野生型C57BL6J小鼠各39只,采用免疫荧光技术分别检测2周龄和2月龄小鼠视网膜组织中5hmC表达情况以及通过qRT-PCR技术和蛋白免疫印迹技术检测Tetl,Tet2和Tet3的表达水平。进一步选取2月龄体重相近健康的雄性小鼠45只,使用视神经夹以相同的力度夹持小鼠右眼球后视神经1 s,夹伤后第7天小鼠右眼为实验组,左眼为空白对照组。探究视网膜神经节细胞损伤过程中5hmC及Tets的变化情况。结果:(1)免疫荧光技术检测显示在小鼠发育过程中2周龄和2月龄小鼠视网膜组织中5hmC均有表达,相较2周的小鼠视网膜组织,2月的小鼠视网膜组织5hmC在视网膜各层细胞(GCL,IVL和ONL)均表达。此外,5hmC表达位于视网膜神经节细胞,并且与Brn3a在细胞内共定位。(2)无论是出生后2周还是2个月的小鼠视网膜组织中,Tet3蛋白含量最高,Te3次之,Tetl最低。随后,qRT-PCR和蛋白免疫印迹结果显示随着年龄的增加,Tetl与Te3蛋白表达呈现下降趋势,而Tet3蛋白的表达增加,差异有统计学差异(P<0.05)(3)视神经夹伤第7天,视网膜神经节细胞中5hmC及Tet3的表达出现明显降低。结论:5hmC参与小鼠视网膜成熟过程,Tet3是小鼠视网膜成熟过程中的主要调节蛋白。此外,5hmC及Tet3是视网膜神经节细胞成熟过程中稳定的标志物,可能是视网膜神经节细胞保护的新靶点。

DNA羟甲基化与表观遗传学调控

表观遗传学中的DNA甲基化与疾病的发生发展密不可分.DNA甲基化中的5-甲基胞嘧啶易发生氧化形成5-羟甲基胞嘧啶.此过程又称为羟甲基化修饰,已成为表观遗传学研究的一种新热点.羟甲基化与10-11易位家族蛋白(ten-eleven translocation,TET)的作用密切相关,它参与了基因的表达调控以及DNA去甲基化过程.最近的羟甲基化研究主要集中在癌症和精神性疾病.针对日趋增多的相关研究,本文对DNA羟甲基化进行了全景式综述.

帕金森病小鼠CatWalk行为学研究

目的通过Cat Walk步态分析系统,对帕金森小鼠模型的步态变化进行分析评估。方法用MPTP诱导建立帕金森小鼠模型,在建立模型成功后,利用Cat Walk步态分析仪进行相关步态参数的测定,并对测定结果进行统计分析。结果与空白对照组相比,模型组小鼠脚步模式混乱;小鼠通过某特定距离的时间(run duration)、最大速率变化(maximum variation)、支撑相时间(stance)、脚步周期(step cycle)显著增加;而平均速度(average speed)、单位时间脚步数(cadence)、摆动速度(swing speed)、步幅(stride length)显著降低。结论 Cat Walk可以作为评估帕金森小鼠模型行为学变化的一种更直观、精确、有效的新方法。

去甲斑蝥素对胃癌细胞生物学行为的影响及机制研究

目的采用体外实验探讨去甲斑蝥素对胃癌细胞生物学行为的影响,初步研究其相关作用机制。方法本实验分成Control组和NCTD组,CCK8实验检测2组细胞的DNA增殖情况,划痕实验检测2组细胞的转移能力,Western blotting检测2组细胞中TETs蛋白的表达。结果CCK8增殖实验中甲斑蝥素预处理能明显降低吸光度增加速率;划痕实验甲斑蝥素能明显抑制人胃癌AGS细胞的愈合能力;Western blotting实验中甲斑蝥素能明显增加TET1蛋白表达,对TET2和TET3的影响不明显。结论去甲斑蝥素可能通过提高TET1的表达量激活细胞内主动去甲基化,抑制肿瘤细胞的增殖和迁移。

5-羟甲基胞嘧啶在神经退行性疾病中的作用研究进展

神经退行性疾病是一种慢性进行性疾病,包括阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)、多系统萎缩(multiple system atrophy,MSA)、亨廷顿病(Huntington disease,HD)等,其病因目前尚不清楚。近年研究表明,5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5hmC)可能参与了AD、PD、HD等多种神经退行性疾病的发生机制。本文就近年来5hmC与表观遗传学的关系、TET家族蛋白及5hmC在神经退行性疾病中的作用进行综述。

肝母细胞瘤细胞中STAT3异常表达的DNA甲基化分子机制研究

目的探讨肝母细胞瘤(hepatoblastoma,HB)肿瘤组织中信号转导与转录激活因子3(signal transducer and activator oftranscription 3,STAT3)高表达的DNA甲基化机制。方法以湖南省儿童医院普外一科于2016年5月至2019年3月收治的20例HB患儿为研究对象,其中男12例,女8例,中位年龄为33个月,年龄范围为3~72个月;3例甲胎蛋白含量<3000μg/L,17例甲胎蛋白含量>3000μg/L;7例为胎儿型HB,7例为胚胎型HB,1例为未分化型HB,5例为混合型HB;按HB的PRETEXT分期系统分期,Ⅰ期3例,Ⅱ期6例,Ⅲ期6例,Ⅳ期5例。手术切取HB肿瘤及癌旁正常组织,肿瘤组织的切除范围参照术前影像学检查结果,并扩大1~2 cm切除,癌旁正常组织需切取离肿瘤边缘至少2 cm的正常组织。将肿瘤组织作为实验组,癌旁正常组织作为对照组。采用实时定量聚合酶链反应(quantificational real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)及蛋白质印迹法检测实验组和对照组中STAT3和TET的表达水平。采用亚硫酸氢盐测序PCR(bisulfite sequencing PCR,BSP)技术检测实验组和对照组中STAT3启动子区DNA甲基化水平。使用染色质免疫共沉淀(chromatin Immunoprecipitation,ChIP)-定量聚合酶链反应(quantitative PCR,qPCR)检测实验组和对照组中STAT3启动子区TET1结合水平,并将实验组中TET1结合水平与STAT3启动子DNA甲基化水平做相关性分析。结果在两组间STAT3的表达水平差异方面,qRT-PCR检测结果显示,实验组与对照组STAT3的表达水平相比(8.43±5.05比1.03±0.41),实验组STAT3的表达水平显著升高,差异具有统计学意义(t=-6.53,P<0.001);蛋白质印迹法检测证实了实验组STAT3表达水平的上调,实验组与对照组相比(0.96±0.17比0.37±0.13),差异具有统计学意义(t=-12.13,P<0.001)。在两组间STAT3启动子DNA甲基化水平的差异方面,BSP检测结果显示,实验组与对照组STAT3启动子区DNA甲基化水平相比(0.52±0.10比0.82±0.06),实验组STAT3启动子区DNA甲基化水平显著降低,差异具有统计学意义(t=11.73,P<0.001)。实验组的STAT3 mRNA水平与其启动子区DNA甲基化水平的相关性分析结果显示,STAT3 mRNA水平与其启动子区DNA甲基化水平呈显著负相关,差异具有统计学意义(r=-0.704,P=0.001)。qRT-PCR检测显示实验组与对照组TET的表达水平相比(4.81±2.25比1.10±0.42),实验组TET1表达水平明显上调,差异具有统计学意义(t=-7.227,P<0.001);两组间TET2和TET3的表达差异无统计学意义,实验组与对照组TET2表达水平为1.33±0.54比1.07±0.46(t=-1.624,P=0.113),TET3表达水平为1.77±1.03比1.33±0.89(t=-1.43,P=0.161)。蛋白质印迹法检测结果显示实验组与对照组TET1表达水平相比(0.77±0.18比0.27±0.09),实验组TET1表达水平增加,差异具有统计学意义(t=-11.392,P<0.001)。在两组间STAT3启动子区TET1的结合水平方面,ChIP-qPCR结果显示,实验组与对照组相比(3.72±1.47比1.28±0.73),实验组STAT3启动子区TET1结合水平显著升高,差异具有统计学意义(t=-6.63,P<0.001)。实验组STAT3启动子区TET1结合水平与STAT3启动子区DNA甲基化水平的相关性分析结果显示,实验组STAT3启动子区TET1结合水平与DNA甲基化水平呈显著负相关,差异具有统计学意义(r=-0.658,P<0.01)。结论HB患儿肿瘤组织中TET1的表达升高可能是导致STAT3启动子DNA低甲基化,进而过度表达的原因之一。