通过miRNA-TF-mRNA调控网络揭示儿童1型糖尿病的潜在生物标志物

目的通过miRNA-TF-mRNA调控网络来预测儿童1型糖尿病(T1D)的潜在生物标志物。方法以基因表达综合数据库(GEO)的GSE33440数据集为基因表达阵列。利用R包微阵列数据线性模型(LIMMA)识别差异表达基因(DEG)、加权基因共表达网络分析(WGCNA)筛选最重要模块,共同基因(CGs)被确定为DEG和最重要模块中的基因的交叉点;对CGs进行GO、KEGG通路富集分析;通过miRNA-TF-mRNA调控网络预测潜在生物标志物。结果识别出51个DEG和9个重要模块;筛选出了12个CGs;CGs富集在腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信号通路以及胰岛素受体底物2基因(IRS2);在miRNA-TF-mRNA调控网络中miR-499b-5p可靶向IRS2,通过AMPK信号通路调节儿童T1D。结论研究揭示了miR-499b-5p/IRS2可能被视为儿童T1D的潜在治疗靶点。

人凋亡相关基因TFAR19缺失突变体的原核表达、产物纯化及鉴定

构建TF 1细胞凋亡相关基因 19(TF 1cellapoptosisrelatedgene 19,TFAR19)缺失突变体的原核表达载体 ,获取缺失突变体蛋白 ,用于TFAR19促凋亡分子机理的研究 .从真核表达载体pcDI TFAR19扩增出野生型TFAR19和 4个缺失突变体 ,重组到原核表达载体pGEX 4T 2 .经亲和层析方法对缺失体蛋白进行纯化后 ,再利用凝胶过滤的方法进一步纯化 .利用抗GST和抗TFAR19的单克隆抗体对蛋白进行免疫学鉴定 .用白血病细胞株HL 6 0检测蛋白活性 .成功地克隆并重组了野生型TFAR19及缺失突变体 pGEX 4T 2表达载体 ,对融合蛋白的表达条件进行了优化 .SDS PAGE结果显示 ,各个缺失突变体融合蛋白均有较高水平的表达 .免疫学检测证实获得了正确的表达产物 .活性检测证实 ,野生型TFAR19和缺失突变体 4可以明显促进去血清诱导的HL 6 0细胞凋亡 ,第

TF-1细胞凋亡相关基因19在系统性红斑狼疮发病中的作用

目的 :探讨TF - 1细胞凋亡相关基因 1 9(TFAR1 9)在系统性红斑狼疮 (SLE)发病诱因中的作用及其与SLE病情的关系。方法 :应用倒置相差显微镜、Ladder方法、Westernblotting方法、荧光免疫显微镜、ELISA方法检测中波紫外线 (UVB)诱导HaCaT细胞凋亡时TFAR1 9的表达及其与SLE患者病情的关系。结果 :在剂量为 30mJ/cm2的UVB照射 2 4h后 ,HaCaT细胞开始凋亡 ,TFAR1 9在此过程中有表达 ,发现活动期SLE患者血清中TFAR1 9的抗体值高于稳定期和正常对照组的值 (P≤ 0 .0 5)。结论 :在UVB诱导角质形成细胞HaCaT凋亡的过程中 ,有TFAR1 9的参与并发挥了作用 ,提示TFAR1

重组TFAR19蛋白对鼻咽癌CNE-1细胞端粒酶活性和细胞凋亡的影响

目的研究重组TFAR19(TF-1cellapoptsis-relatedgene19)蛋白对鼻咽癌细胞株CNE-1端粒酶活性及端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA表达的影响,探讨重组TFAR19蛋白促CNE-1细胞凋亡的作用机制。方法将不同浓度的高纯度重组TFAR19蛋白分别和人类鼻咽癌细胞株CNE-1共同培养后,通过7-AAD及AnnexinV-PE标记进行流式细胞术分析,检测TFAR19蛋白对细胞的促凋亡效应;RT-PCR法比较试验组和对照组CNE-1细胞株端粒酶hTERTmRNA的表达水平;TRAP-银染法检测重组TFAR19蛋白作用下CNE-1细胞株端粒酶活性的改变。结果(1)一定浓度的TFAR19蛋白在未加载体的情况下,可促进细胞凋亡,加入5、10、15、20、30mg/L的TFAR19蛋白后,CNE-1细胞的凋亡率分别是15.26%,29.48%,37·11%,54·20%,72.36%。阳性对照组(凋亡诱导剂stuanrosporin处理)与阴性对照组(PBS处理)的细胞凋亡率分别是98·37%、13·40%。(2)试验组与对照组CNE-1细胞株端粒酶hTERTmRNA表达无显著差异。(3)与20mg/L以上浓度的重组TFAR19蛋白共同培养后,CNE-1细胞株端粒酶活性明显降低。结论重组TFAR19蛋白在较高浓度下可降低鼻咽癌细胞株CNE-1的端粒酶活性,明显促进肿瘤细胞凋亡。

中波紫外线诱导HaCaT细胞凋亡中TF-1细胞凋亡相关基因19的表达

目的:研究在中波紫外线(UVB)诱导正常永生化角质形成细胞(HaCaT)凋亡过程中,T细胞凋亡相关基因19(TFAR 19)的表达时相及位置。方法:使用流式细胞仪、膜联蛋白V(Annexin-V)、激光扫描共聚焦显微镜等方法进行研究。结果:在凋亡过程中,TFAR 19逐渐向核周聚积,最后向核膜内移位,在核膜及其周围以及核内表达。 结论:在UVB诱导HaCaT细胞凋亡的早期和晚期过程中TFAR 19均有表达。

人红系分化相关基因高表达提高TF-1细胞系存活能力

目的:检测人红系分化相关基因(EDAG)对TF-1细胞株存活能力的影响。方法:采用电转染法将过表达EDAG的质粒高效转染TF-1细胞株,通过G418筛选得到过表达EDAG的TF-1细胞稳定株,用MTS法检测过表达EDAG的细胞稳定株在撤除细胞因子后的增殖情况,用流式细胞术检测细胞凋亡。结果:用表达GFP的质粒电转染TF-1细胞株,通过综合评价转染效率和细胞状态,确定最佳转染条件为1350 V电压电击30 ms,电击次数为1次;对得到的细胞稳定株进行检测,其内源EDAG的mRNA和蛋白水平均上调;将细胞稳定株在撤除细胞因子状态下培养,过表达EDAG后细胞存活能力增强、凋亡减少。结论:用电转染方式高效转染TF-1细胞,通过筛选得到过表达EDAG的稳定细胞株,并证实撤除细胞因子后过表达EDAG能提高TF-1细胞系的存活及抗凋亡能力。

天祝白牦牛转铁蛋白(Tf)基因克隆及生物信息学分析

目的:克隆天祝白牦牛转铁蛋白(Transferrin,Tf)基因,并对其序列及蛋白进行遗传特性分析,为研究Tf生物学作用和生产应用提供理论依据。方法 :以成年天祝白牦牛肝脏组织为实验材料,根据牦牛Tf基因CDS区序列设计引物,利用PCR和逆转录PCR(reverse transcription,RT-PCR)技术克隆获得天祝白牦牛Tf基因编码区序列,并结合生物信息学方法分析其遗传特性。结果:PCR扩增获得了大小为2 115 bp的基因片段,为Tf基因的完整编码区,编码704个氨基酸,其N端有一个19个氨基酸组成的信号肽,含2个高度保守的同源结构域,N端结构域组成为第25到363位氨基酸(339aa),C端结构域组成为第364-693位氨基酸(330aa),两端结构域的同源性为42%;Tf基因编码的蛋白分子量为75.78 k Da,理论等电点为6.63。序列分析显示,克隆获得的Tf基因序列存在4个碱基的变异,第57位发生碱基转换(A←→G),第750位发生碱基转换(T←→C),为同义突变;第482位发生碱基转换(A←→T),第511位发生碱基转换(T←→C),为错义突变,引起第161、171位氨基酸发生改变(L→G、L→F)。DNAman软件进行氨基酸同源性分析表明,天祝白牦牛Tf基因氨基酸序列与野牦牛、牛、水牛、藏羚羊、绵羊、野猪、人、鼠、鸡和鱼Tf氨基酸序列间的同源性分别为100%、99%、96%、94%、93%、75%、69%、64%、51%、39%,说明天祝白牦牛Tf蛋白与其他物种同源,与牛类进化水平较为接近,与鸡和鱼类进化水平较远。同源建模预测Tf三级结构模型显示,天祝白牦牛Tf三级结构是在二级结构基础上经肽链折叠形成2个邻近相似的N端、C端结构域,N端结构域含N1、N2两个亚基,C端结构域含C1、C2两个亚基。结论:从天祝白牦牛肝脏组织中提取总RNA,克隆获得Tf基因编码区全长序列,并揭示了其分子遗传特性,为牦牛Tf蛋白基因工程和蛋白质功能的研究奠定了基础。

利用TALE-TFs在小鼠成纤维细胞中激活β-酪蛋白基因启动子表达载体

目的利用TALE-TFs,在小鼠成纤维细胞中激活β-酪蛋白基因启动子,为检测β-酪蛋白基因启动子—目的基因表达框的表达结果,提供一种检测途径。方法将构建的TALE-TFs和β-酪蛋白基因启动子—Red报告基因质粒电转染进入小鼠成纤维细胞,通过荧光显微镜直接观察报告基因表达情况。结果与结论利用TALE人工转录因子,在小鼠成纤维细胞中能够激活β-酪蛋白基因启动子表达框,为替代乳腺上皮细胞表达验证系统提供了新的途径。

硼替佐米诱导TF-1细胞凋亡及其对SALL4基因表达的影响

目的:探讨蛋白酶体抑制剂硼替佐米(Bortezomib)诱导人红系白血病细胞株TF-1凋亡的作用,及其对Sall4基因表达水平的影响。方法:(1)MTT法检测细胞增殖抑制率。(2)光学显微镜观察细胞的形态学改变。(3)电镜观察超微结构变化。(4)流式细胞仪检测Annexin V-FITC细胞凋亡率。(5)流式细胞仪分析细胞周期。(6)RT-PCR检测Sall4 mRNA的表达水平。结果:(1)硼替佐米呈时间和剂量依赖性抑制TF-1细胞生长,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。24 h和48 h的药物半数抑制浓度(Halfmaximal inhibitory concentration of a substance,IC50)分别为52 nmol/L和27 nmol/L。(2)显微镜下观察细胞皱缩变小,细胞密度明显下降。(3)电镜下观察可见凋亡小体。(4)Annexin V-FITC检测显示随着硼替佐米作用浓度的增加,凋亡率增加,呈剂量依赖关系(P<0.05)。(5)流式细胞仪分析细胞周期,随着硼替佐米作用时间的增加,G2/M期细胞比例逐渐增高,而G0/G1和S期细胞比例则逐渐减少,呈时间依赖关系(P<0.05)。(6)RT-PCR结果示Sall4基因在TF-1细胞上高表达,并随着硼替佐米作用浓度和时间的增加,Sall4 mRNA与β-actin mRNA表达量的积分光密度比值(Integral optical density ratio,V/B)水平下降(P<0.05)。结论:硼替佐米能抑制TF-1细胞增殖,诱导其凋亡,呈时间-剂量依赖关系。Sall4基因在TF-1细胞株上高表达,并随着硼替佐米作用浓度和时间的增加表达水平下降,呈时间-剂量依赖关系。

循经针刺联合非手术脊柱减压对腰椎间盘突出症腰椎功能及血清TFAR19、Apaf-1的影响

目的探讨循经针刺联合非手术脊柱减压对腰椎间盘突出症腰椎功能及血清TF-1细胞凋亡相关基因19(TFAR19)、凋亡蛋白酶激活因子-1(Apaf-1)的影响。方法选取2018年6月—2020年7月该院收治的94例腰椎间盘突出症患者,随机分为对照组与观察组,各47例。对照组给予非手术脊柱减压治疗,观察组在对照组基础上另给予循经针刺治疗。对比治疗前、治疗3个月后腰椎功能[日本骨科协会腰椎功能(JOA)评分、Oswestry功能障碍指数(ODI)评分]及治疗前、治疗1个月、治疗3个月的腰腿疼痛评分[视觉模拟评分法(VAS)],并比较临床疗效及治疗前、治疗1个月、治疗3个月的椎旁肌肉肌电变化情况,另比较治疗前、治疗3个月后血清TFAR19、Apaf-1水平变化情况及治疗期间不良事件发生情况。结果两组治疗3个月后JOA评分均高于治疗前(P<0.05),观察组治疗3个月后高于对照组(P<0.05);两组治疗3个月后ODI评分均低于治疗前(P<0.05),观察组治疗3个月后低于对照组(P<0.05);两组治疗1个月、3个月的VAS评分均低于治疗前(P<0.05),治疗3个月的VAS评分均低于治疗1个月(P<0.05);观察组治疗1个月、3个月的VAS评分均低于对照组(P<0.05);观察组总有效率高于对照组(P<0.05);两组治疗1个月、3个月的竖脊肌及多裂肌积分肌电值(IEMG)、平均振幅、平均频率斜率均高于治疗前(P<0.05),治疗3个月均高于治疗1个月(P<0.05);观察组治疗1个月、3个月的竖脊肌及多裂肌IEMG、平均振幅、平均频率斜率均高于对照组(P<0.05);两组治疗3个月后血清TFAR19、Apaf-1水平均低于治疗前(P<0.05),观察组治疗3个月后血清TFAR19、Apaf-1水平均低于对照组(P<0.05);两组治疗期间不良事件发生率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论循经针刺联合非手术脊柱减压治疗腰椎间盘突出症患者,可明显减轻患者腰腿疼痛感,改善腰椎功能及椎旁肌肉肌力,提升椎旁肌群稳定性,降低血清TFAR19、Apaf-1水平,提高临床疗效,且安全性良好。

利用结构优化的TALE-TF高效诱导MEF细胞内源基因Oct4的表达（英文）

转录激活子样效应因子核酸酶(TALENs)已用于基因组编辑,而TALE转录激活因子(TALE-TFs)可用于内源基因的调控。通过修饰的TALE蛋白与内源基因的启动子特异性结合来激活或抑制基因的表达。但是,对于截短了N端的TALE是否会影响TALENs的效率还不确定。本文设计了不同长度N端的TALENs哺乳动物及酵母表达载体,对应哺乳动物绿色荧光报告载体及酵母报告载体。分别在哺乳动物细胞和酵母细胞上对不同长度N端TALENs的活性进行了检测。检测结果发现,含120个氨基酸N端的TALEN在酵母AH109细胞中的活性最高,N端长度为153个氨基酸的TALENs在293T细胞中表现最高的活性,但N端长度为153、140和160个氨基酸的TALENs的活性差异不显著(P>0.05)。随后,将结构优化了的TALE-TF用于小鼠胎儿成纤维细胞中激活Oct4基因。相对阴性对照组,TALE-TF将Oct4基因表达量上调了418倍。本研究结果表明,在哺乳动物细胞和酵母细胞中,具有最高活性TALENs的N端长度是不同的。本研究用结构优化的TALE-TF诱导内源基因高水平的表达,为从体细胞中获得iP S细胞提供了研究策略。

绵羊成纤维细胞中TALE-TFs激活β酪蛋白基因启动子研究

针对绵羊β-酪蛋白基因启动子序列设计4个人工转录因子TALE-TFs。电转染TALE-TFs进入绵羊成纤维细胞中，通过实时荧光定量和Western blotting检测β-酪蛋白基因表达，筛选获得激活效果较好的TALE-TF1。将TALE-TF1和β-酪蛋白基因启动子、Red报告基因质粒电转染进入绵羊成纤维细胞，通过荧光显微镜直接观察报告基因Red表达。利用TALE人工转录因子，在绵羊成纤维细胞中能够激活β-酪蛋白基因启动子表达框，为替代乳腺上皮细胞表达验证系统提供了一种检测途径。

玉米SBP转录因子全基因组鉴定与功能分析

SBP基因家族是一类植物基因组特有的转录因子,参与植物生长发育及多种生理生化过程。近来,大量研究已在多种植物中鉴定出SBP转录因子,但关于玉米(Zea mays L.)SBP转录因子家族的系统分析报道尚少。本研究通过对拟南芥、水稻等植物已知的转录因子与玉米基因组数据比对,并设置一系列严格的筛选标准从玉米基因组中挖掘SBP转录因子,系统发育分析显示单子叶植物玉米和水稻的SBP基因保守性更强、亲缘关系更近;共鉴定37个SBP基因,分布在9条染色体上;通过基因分析注释以及启动子功能预测,进一步发现SBP家族基因参与植物生长发育、形态建成、逆境胁迫响应、花器官发育以及植物光反应等过程。并且,玉米SBP转录因子可通过参与赤霉素、生长素、脱落酸、水杨酸等多条激素信号调控途径来调节植物的生长发育。

转铁蛋白基因表达与低氧适应

转铁蛋白(TF)是运输铁离子的重要蛋白,其与低氧有密切联系。研究比较了藏鸡在常氧(02,21%)和低氧(02,13%)孵化环境中胚胎尿囊绒毛膜(CAM)组织7T基因mRNA表达变化及其与茶花鸡的差异,以及在不同氧气浓度培养条件下鸡胚成纤维细胞(DF-1)中7T基因的mRNA表达变化,阐述7T基因表达与低氧适应的关系。结果显示:在鸡胚孵化期第11~16天,藏鸡CAM组织中7T基因在低氧环境下的表达高于常氧环境及茶花鸡(P<0.05),且低氧明显刺激DF-1细胞中rF基因的表达(P<0.05)。研究表明在低氧环境中藏鸡CAM组织7T基因表现出明显的增加,促进了血液中Fe>的运输以及增加血氧结合能力从而使其胚胎能更好的适应低氧环境。

肾透明细胞癌PDCD5表达及与预后的关系

目的探讨PDCD5在肾透明细胞癌发生、发展中的作用及与预后关系。方法采用免疫组织化学方法,对46例肾透明细胞癌组织中PDCD5表达进行研究,对患者存活率进行回顾性随访。结果癌旁肾组织中PDCD5阳性表达率显著高于肾癌组织。PDCD5阳性表达率随肾透明细胞癌病理分级和临床分期的上升而下降,染色强度也减弱。PDCD5阳性表达组3年及5年存活率高于阴性表达组。结论PDCD5为肾透明细胞癌的负性调节因子,对抑制肾透明细胞癌的恶性转化和进展可能有重要的意义。

乌桕SsSAD基因的原核表达与纯化研究

乌桕是一种重要的木本油料树种。SAD(stearoyl-acyl ACP desaturase)是油料植物中将饱和脂肪酸转变成不饱和脂肪酸的一种关键脱氢酶。为了进一步揭示乌桕SsSAD的功能,该研究在大肠杆菌中表达了该蛋白。结果表明:(1)通过RT-PCR的方法从乌桕种子中克隆出了SsSAD基因编码区全长序列,并将其克隆到低温诱导的原核表达载体pCold TF上,构建原核重组表达载体pCold TF/SsSAD,转化大肠杆菌BL 21star(DE3)并获得原核表达工程菌株。(2)通过IPTG法低温诱导表达融合蛋白。该重组质粒在大肠杆菌中得到了高效表达,融合蛋白分子质量约为101kD,且在上清液和包涵体中均有表达,可溶性部分经亲和层析纯化和Western blotting检测证实获得了重组蛋白,上述结果为进一步研究乌桕SsSAD的结构和功能奠定了基础。

一种检测小鼠转录因子活性的微阵列芯片的构建及应用

转录因子是一类具有序列特异性的双链DNA结合蛋白.在哺乳动物细胞中,一个转录因子可以调控多个靶基因,一个基因也同时受到多个转录因子的调控,从而形成复杂的基因表达网络调控机制.在蛋白质水平检测特定状态下组织或细胞中的转录因子活性对深入研究基因表达调控的分子机制具有重要的意义.针对TRANSFAC数据库提供的226个小鼠转录因子的PSSM,设计了240个转录因子结合探针,构建了可以在蛋白质水平同时检测约200个小鼠转录因子的微阵列芯片,实验结果显示:a.针对含有不同DNA结合结构域的7个转录因子,进行依赖于抗体的转录因子活性检测,结果证明该芯片具有良好的特异性;b.针对NFκB转录因子纯品,芯片的检测灵敏度可以达到0.5nmol/L,线性范围为0.5～20nmol/L,表明芯片具有较高的灵敏度和良好的定量能力;c.针对经典的IKK,JNK信号通路和JAK/STAT信号通路,该芯片可以检测到其关键转录因子的活性变化,证明芯片的可靠性;d.针对小鼠前脂肪细胞系3T3-L1的分化,该转录因子活性芯片不但检测到了已经报道的活性发生变化的转录因子,如PPAR家族和C/EBP家族外,还发现了以前没有报道过的SRF等,充分显示了芯片技术的高通量优势和发现新数据的能力.

甘蓝型油菜BnCOP1基因的原核表达和纯化

COP1蛋白是植物光信号调节网络中介导光信号转导的一个关键因子,对植物生长发育起重要调控作用.通过RT-PCR方法从甘蓝型油菜中克隆BnCOP1基因编码区全长序列,并将其连接到冷诱导原核表达载体pCold TF上,构建原核重组表达载体pCold TF/BnCOP1,转化大肠杆菌BL(21)star.通过IPTG法低温诱导表达融合蛋白.结果表明,重组质粒在大肠杆菌中获得高效表达,融合蛋白分子质量约为128 kD,融合蛋白在上清液和包涵体中均有表达,可溶性部分经亲和层析纯化和Western blotting检测证实获得了高纯度的重组蛋白,这些结果为进一步研究油菜BnCOP1的结构和功能奠定了基础.

果蝇程序化死亡基因5(PDCD5)同源cDNA的克隆和序列分析

为了解人类白血病细胞凋亡相关新基因 TFAR1 9(PDCD5,programmed cell death5)在不同种属间的序列同源性 ,利用 EST(expression sequence tag)拼接、RT- PCR、DNA序列测定技术及计算机分析技术 ,首次成功地进行了果蝇 PDCD5同源 c DNA编码区基因克隆和序列分析 .发现果蝇与小鼠及果蝇与人 PDCD5在核苷酸水平上分别有 57.5%和 57.1 %的同源性 ,在氨基酸水平上分别有 46.8%和 46.4%的同源性 .功能区分析发现 ,果蝇 PDCD5c DNA编码 1 33个氨基酸 ,计算机预测可能是一种核蛋白 ,含 5个可能的酪蛋白激酶 (casein kinase )磷酸化位点 ,2个可能的 PKC磷酸化位点 ,与人 PDCD5的功能区类似 .因而果蝇 PDCD5是与人 PDCD5同源的新基因 ,可能都与细胞程序化死亡相关 .

猪全基因组范围ETS基因家族成员的鉴定、进化与表达分析

ETS转录因子家族在动物中广泛存在,参与细胞分化调控、细胞周期控制、细胞凋亡等多个生物学过程。文章采用生物信息学方法系统分析猪ETS家族成员进化关系和调控图谱,结合RNA-Seq数据分析其组织表达规律。研究利用Pfam鉴定ETS保守结构域序列检索猪(Sus scrofa)蛋白序列,最终在猪基因组上鉴定得到23个ETS家族基因。分析ETS家族基因、蛋白一级结构和高级结构及亚细胞定位预测。基于最大似然法,构建ETS家族系统发育树发现,可分为11个子家族,子家族成员保守结构域、基因结构、理化性质相似。通过生信分析构建由ETS家族、靶基因和miRNA构成的基因调控网络,筛选出40个"ETS家族基因-miRNA-靶基因"前馈回路。转录表达谱提示ETS家族基因在成年公猪和母猪28种不同类型组织中均有表达,且ETS1基因在免疫组织(淋巴、脾脏)和外周血单核细胞中高表达,SPIC基因在免疫组织(淋巴、脾脏)高表达。研究结果为揭示ETS家族成员生物学功能奠定基础。