TGFβⅠ型和Ⅱ型受体在鼠磨牙牙胚发育过程中免疫组化定位及生物学意义探讨

目的 :探讨TGFβI、II型受体在鼠磨牙牙胚发育过程中的生物学作用。 方法 :用免疫组织化学检测转化生长因子 βI型受体 (TβRI)、II型受体 (TβRII)在鼠下颌第一磨牙牙胚发育过程中的定位。 结果 :TβRⅠ、TβRⅡ在鼠磨牙牙胚发育过程中呈时间 -空间特异性分布 ,其分布模式与其配体TGFβ1～ 3蛋白的分布模式基本一致。 结论 :TβRⅠ、TβRⅡ在成釉器的早期形态发生。

截短型人转化生长因子βⅡ型受体胞外域的表达及活性分析

目的构建截短型人转化生长因子βⅡ型受体胞外域(thTβRⅡ)原核表达载体,诱导表达纯化thTβRⅡ蛋白,并分析其生物学活性。方法以本实验室前期构建的TβRⅡ全长基因片段(p GEX-4T1-TβRⅡ)为模版,常规PCR扩增出带有Nde I和Bam HI酶切位点的thTβRⅡ目的基因,并插入原核表达载体p ET28a,命名为p ET28a-thTβRⅡ。将经过PCR、双酶切和DNA测序正确的p ET28a-thTβRⅡ转化至大肠杆菌Rossta诱导表达,用Ni^(2+)亲和层析纯化获得高纯度thTβRⅡ目的蛋白,经SDS-PAGE进行纯度分析,MTT法观察其对转化生长因子-β1(TGF-β1)活化的人肝星状细胞LX-2增殖活性的影响,real-time RT-PCR及Western blot检测其对TGF-β1、纤连蛋白(FN)mRNA及FN、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达的影响。结果 p ET28a-thTβRⅡ原核表达载体构建成功,宿主菌Rossta/p ET28a-thTβRⅡ在37℃经0.8mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导5 h获得目的蛋白thTβRⅡ的大量表达,目的蛋白主要以包涵体的形式存在,通过Ni^(2+)亲和层析成功获得高纯度thTβRⅡ,SDS-PAGE鉴定分子量约为18.0 kD,MTT显示150μg/mL的重组蛋白thTβRⅡ能明显抑制活化的人肝星状细胞LX-2增殖,real-time RT-PCR及Western blot显示200μg/mL的重组蛋白thTβRⅡ其能显著减少TGFβ1、FNmRNA;FN、α-SMA蛋白的表达。结论成功构建thTβRⅡ原核表达载体,诱导表达纯化并获得高纯度重组蛋白thTβRⅡ,其能抑制活化的LX-2细胞增殖并具有抗纤维化作用,为进一步体内外功能研究打下基础。

TGF-β1和TGF-βⅡ型受体酵母表达载体构建

目的克隆人转化生长因子β1(TGF-β1)和4个受体基因片段,构建酵母表达载体,为应用酵母双杂交筛选与TGF-β1相互作用的TβRⅡ区域提供技术支持。方法提取人血液中RNA,逆转录转为c DNA,PCR扩增TGF-β1和4个受体(TβRⅡ-A、TβRⅡ-B、TβRⅡ-C、TβRⅡ-D)基因片段,双酶切后,分别插入酵母双杂交表达载体p GBKT7和p GADT7;经过PCR扩增、双酶切和DNA测序鉴定后,构建质粒p GBKT7-TGF-β1和p GADT7-TβRⅡ-A、p GADT7-TβRⅡ-B、p GADT7-TβRⅡ-C和p GADT7-TβRⅡ-D。结果成功扩增TGF-β1基因(1 200 bp)和TβRⅡ-A(453bp)、TβRⅡ-B(366 bp)、TβRⅡ-C(276 bp)和TβRⅡ-D(165 bp)基因片段,经PCR、双酶切和DNA测序鉴定插入到酵母双杂交载体序列正确。结论成功构建p GBKT7-TGF-β1和p GADT7-TβRⅡ-A、p GADT7-TβRⅡ-B、p GADT7-TβRⅡC和p GADT7-TβRⅡ-D酵母双杂交表达载体。