人成熟型TGF-β_1基因克隆、表达纯化及抗原性的检测

目的 :构建人成熟型TGF - β1基因原核表达载体 ,表达并纯化人成熟型TGF - β1融合蛋白。方法 :应用基因重组的方法 ,构建成熟型TGF - β1原核表达载体 ,诱导表达人成熟型TGF - β1的融合蛋白 ,并应用亲和层析法纯化重组融合蛋白 ,应用Western -Blot鉴定其抗原性。结果 :成功构建人成熟型TGF - β1原核表达载体 ,获得人成熟型TGF - β1融合蛋白 ,其抗原性较好。结论 :人成熟型TGF - β1基因原核表达载体的成功构建 ,可高效表达人成熟型TGF - β1融合蛋白 ,为进一步研究其功能和获得其多克隆抗体奠定了基础 ,并为开发国产人TGF - β1诊断试剂做必要的准备 ,对肝纤维化的防治具有较大意义。

JSRV-Env重组质粒诱导转染TC-1、TC-1-Hyal2细胞后对TGF-α及VEGF因子表达的影响

通过脂质体法将JSRV-Env重组质粒瞬时转染小鼠肺上皮细胞(TC-1)和表达绵羊Hyal-2的小鼠肺上皮细胞(TC-1-Hyal2),而后探讨两细胞中转化生长因子-α(TGF-α)及血管内皮生长因子(VEGF)mRNA和蛋白表达的变化,以此分析TGF-α、VEGF与绵羊肺腺瘤病(ovine pulmonary adenomatosis,OPA)发生的关联性及其在细胞癌变过程中的作用。体外培养TC-1和TC-1-Hyal2细胞,按照不同质粒可将TC-1和TC-1-Hyal2细胞分别设为pEGFP-C1-env转染组、pEGFP-C1转染组和未转染组。利用实时荧光定量PCR和ELISA方法对TGF-α、VEGF的表达水平进行检测。实时荧光定量PCR检测结果表明,相比对照组(pEGFP-C1转染组及未转染组),在转染pEGFP-C1-env的两细胞组中VEGF mRNA的表达量均显著升高(P<0.05);而两细胞组中TGF-αmRNA的表达量均极显著升高(P<0.01)。ELISA检测结果表明,同两对照组相比,转染pEGFP-C1-env的TC-1-Hyal2细胞上清液中VEGF、TGF-α蛋白浓度均极显著升高(P<0.01);且VEGF在相同转染处理的TC-1细胞组中其蛋白浓度也极显著升高(P<0.01),而TGF-α的蛋白浓度呈显著升高(P<0.05)。比较pEGFP-C1转染和未转染各细胞组中TGF-α、VEGF的mRNA和蛋白表达量,结果均无显著差异(P>0.05)。本研究发现,通过实时荧光定量PCR和ELISA方法检测经JSRV-Env诱导转染上述两细胞系后TGF-α、VEGF的mRNA和蛋白表达量均升高,结果提示JSRV-Env可能上调两细胞因子,进而可推测TGF-α、VEGF的表达变化与OPA发病存在一定的关联性,由此为衍生出的OPA针对二者进行基因靶向治疗方案提供重要的理论依据。

人血清白蛋白与PTH(1-34)融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及鉴定

目的:在毕赤酵母中高效分泌表达人血清白蛋白与PTH(1-34)融合蛋白。方法:利用PCR技术获得HSA和PTH(1-34)基因,以柔性连接肽相连插入到表达载体pPIC9,重组质粒线性化后,用化学法转化毕赤酵母GS115,经组氨酸缺陷型培养板和PCR鉴定筛选得到转化子。在启动子AOX1和α交配因子信号肽的作用下,分泌表达融合蛋白HSA-PTH(1-34)。PCR法和电泳鉴定表达验证阳性转化子,并观测不同时间点的表达量。Western blot验证其免疫活性,在兔肾皮质细胞膜中测定腺苷酸环化酶的激活产生cAMP的量来检测融合蛋白的生物学活性。结果:PCR鉴定重组转化子验证了融合基因的成功整合,用甲醇诱导表达,蛋白电泳分析表明融合基因得到高效表达,HSA-PTH(1-34)同时具有HSA和PTH(1-34)的抗原性,且能激活兔肾皮质细胞中的腺苷酸环化酶产生cAMP,但活性低于PTH(1-34)。结论:在毕赤酵母中成功表达了具有生物学活性的人血清白蛋白与PTH(1-34)融合蛋白。

人三叶因子1大肠杆菌及毕赤酵母表达载体的构建与鉴定

目的:构建人三叶因子1(hTFF1)的大肠杆菌及毕赤酵母表达载体。方法:从人胃窦部提取总RNA,经RT-PCR得到hTFF1 cDNA,用PCR方法扩增hTFF1基因,并将其分别克隆到大肠杆菌的表达载体pET32α及毕赤酵母的表达载体pCAPZαA中,构建原核及真核重组表达质粒pET32α-hTFF1和pGAPZαA-hTFF1。结果:通过双酶切和基因序列分析确定插入pET32α和pGAPZαA中的片段为hTFF1基因片段。结论:重组质粒pET32α-hTFF1和pGAPZαA-hTFF1成功构建,为在比较原核和真核细胞中hTFF1高效表达的情况及下一步的功能研究奠定了基础。

PcDNA3/sIL-1RⅠ重组载体体外表达产物生物学活性的检测

目的:检测构建的PcDNA3/sIL-1RⅠ真核表达载体在体外的表达产物是否具有生物学活性。方法:脂质体介导PcDNA3/sIL-1RⅠ体外转染CHO细胞,MTT法检测重组质粒转染的CHO细胞上清液能否阻断IL-1β生物学活性。结果:重组质粒转染的CHO细胞上清液中表达的sIL-1RⅠ能阻断不同浓度IL-1β抑制A375细胞生长的作用。结论:PcDNA3/sIL-1RⅠ重组质粒在体外导入哺乳动物细胞后能够表达具有相应生物学活性的目的产物。

介导人血红素加氧酶-1基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建含人血红素加氧酶-1(HO-1)基因的重组pcDNA3.1质粒并进行鉴定。方法:利用分子生物学技术,从人肝脏标本中提取出RNA,进行RT-PCR后,做TA克隆,成功获得pMD/19-HO-1质粒,采用限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ从pMD/19-HO-1质粒中将目的基因片段切出,克隆到质粒pcDNA3.1的相应酶切位点中,构建重组质粒pcDNA3.1-HO-1,采用限制性酶切、DNA测序鉴定,将构建好的质粒瞬时转染ECV304细胞株,Western blot测定HO-1表达。结果:酶切、测序鉴定证实插入位点及方向与预期完全一致,测序证实hHO-1与Gene Bank提供的原始序列完全一致,瞬时转染细胞后HO-1蛋白表达明显增高。结论:成功构建了含人血红素加氧酶-1基因的真核表达质粒,为进一步研究该基因在糖尿病血管并发症中的作用奠定基础。

重组人CLK1的真核表达及鉴定

目的:合成真核细胞CLK1(Cdc2-like kinase 1)编码基因,构建CLK1/pEGFP-N2真核表达载体并在真核细胞HEK293A中过表达,为CLK1的生物学功能研究奠定基础。方法:从人脐静脉血管内皮细胞中提取总RNA,采用RT-PCR技术用已知引物合成cDNA,将CLK1基因扩增后插入真核细胞表达载体pEGFP-N2,将重组质粒热转化至大肠杆菌感受态Trans 10细胞中获得重组菌株,提取质粒进行酶切鉴定及插入基因测序;将构建的重组质粒转染HEK293A细胞,用Western印迹及免疫荧光检测CLK1的表达水平,同时对其下游的磷酸化SF2/ASF蛋白进行检测。结果:构建了CLK1/pEGFP-N2真核表达载体,将其转染HEK293A细胞后24 h,CLK1蛋白表达水平最高;同时,CLK1过表达后使得下游的SF2/ASF蛋白磷酸化水平升高。结论:构建了人CLK1基因的真核细胞表达载体CLK1/pEGFP-N2,并在HEK293A细胞中过表达,其生物活性也得到了验证。本研究为外源性CLK1基因在真核细胞中过表达提供了一种途径,为CLK1的生物学功能研究奠定了基础,也可为真核细胞其他蛋白表达体系的构建提供借鉴。

细粒棘球绦虫AgB8/1-AgB8/2重组嵌合抗原表达系统的构建

目的构建pET32a-AgB8/1-AgB8/2原核表达载体,并对其重组蛋白进行原核细胞表达。方法从细粒棘球绦虫原头蚴中提取总RNA,反转录生成cDNA,以此cDNA为模板,用基因特异性引物分别扩增EgAgB8/1和EgAgB8/2基因编码其分泌型多肽的片段,经测序后,以此两条基因片段为依据,人工合成EgAgB8/1-EgAgB8/2嵌合抗原编码核酸序列,将其克隆至pUCm-T载体,测序鉴定其正确性。通过对pUCm-T/AgB8/1-AgB8/2重组质粒进行双酶切,将获得的AgB8/1-AgB8/2嵌合抗原编码核酸序列用定向克隆技术克隆至原核表达质粒pET32a上,测序鉴定插入片段正确后,转化至E.coliBL21(DE3)Lys S,IPTG初步诱导表达pET32a-AgB8/1-AgB8/2重组嵌合蛋白。用SDS-PAGE电泳分析鉴定重组蛋白的表达水平。结果测序表明,AgB8/1-AgB8/2嵌合抗原编码核酸序列正方向插入至pET32a质粒。SDS-PAGE电泳分析显示,IPTG诱导后重组嵌合蛋白得到成功表达,在相对分子量约38 kD处有表达条带。结论成功构建了pET32a-AgB8/1-AgB8/2原核表达质粒,并初步诱导表达出AgB8/1-AgB8/2嵌合重组蛋白,为进一步研究其免疫学特性奠定了基础。

细粒棘球绦虫AgB8/1重组抗原表达系统的构建

目的构建pET32a-AgB8/1原核表达载体,并对其重组蛋白进行原核细胞表达。方法从细粒棘球绦虫原头蚴中提取总RNA,反转录生成cDNA,以此cDNA为模板用基因特异性引物扩增EgAgB8/1基因编码其分泌型多肽的片段,经测序后,以此基因片段为依据,人工合成合成EgAgB8/1抗原编码核酸序列,将其克隆至pUCm-T载体,测序鉴定其正确性。通过对pUCm-T/AgB8/1重组质粒进行双酶切,将获得的AgB8/1抗原编码核酸序列用定向克隆技术克隆至原核表达质粒pET32a上,测序鉴定插入片段正确性后,转化至E.coli BL21(DE3)Lys S,IPTG初步诱导表达pET32a-AgB8/1重组蛋白。用SDS-PAGE电泳分析鉴定重组蛋白的表达水平。结果测序表明,AgB8/1抗原编码核酸序列正方向插入至pET32a质粒。SDS-PAGE电泳分析显示,IPTG诱导后重组蛋白得到成功表达,在相对分子量约28 kDa处有表达条带。结论本研究成功构建了pET32a-AgB8/1原核表达质粒,并初步诱导表达出AgB8/1重组蛋白,为进一步研究其免疫学特性奠定了基础。

重组质粒pEGFP-C1-LRIG1的构建及其在SHG44细胞中的稳定表达

目的构建含目的基因多亮氨酸重复区免疫球蛋白样区1(LRIG1)的重组质粒pEGFP-C1-LRIG1,为胶质瘤等多种上皮源性肿瘤的分子治疗奠定基础。方法采用RT-PCR方法,从人全血总RNA中,扩增出3 282bp的LRIG1cDNA片段,再用XhoⅠ和ClaⅠ双酶切后,定向克隆到真核细胞表达载体pEGFP-C1中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;免疫细胞化学法检测LRIG1基因的表达情况。结果人LRIG1基因的cDNA已克隆到真核细胞表达载体pEGFP-C1质粒中;经脂质体转染SHG44细胞后,G418进行筛选,可见转染细胞胞膜上有大量LRIG1蛋白表达。结论成功构建了pEGFP-C1-LRIG1的真核表达载体,为研究LRIG1基因在胶质瘤等多种上皮源性肿瘤中的作用和其治疗奠定一定的实验基础。

PET32a-IL-1RⅠ重组质粒的构建及表达

目的构建含有编码白细胞介素1Ⅰ型受体(IL-1R I)胞外区蛋白基因的PET32a-IL-1RⅠ重组质粒,利用原核表达体系表达IL-1RⅠ的胞外区蛋白。方法从人白细胞中提取总RNA,采用聚合酶链反应(PCR)从总RNA中扩增出IL-1RⅠ胞外段基因,并将其插入PET32a质粒,构建重组质粒,化学法转化大肠杆菌DH5α进行克隆。将克隆得到的PET32a-IL-1RⅠ重组质粒转化入表达菌株BL21(DE3),通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导其蛋白表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western-Blot鉴定蛋白表达效果。结果菌落PCR及DNA测序证实IL-1RⅠ胞外段基因已正确克隆到载体中;重组质粒成功转入表达菌株BL21(DE3),SDS-PAGE和Western-Blot结果显示表达菌经IPTG诱导后表达出相对分子质量为67×103左右的蛋白。结论成功地克隆了人IL-1RⅠ胞外段基因并在大肠杆菌中进行了表达,为IL-1RⅠ的进一步研究打下了基础。

弓形虫SAG1-GRA1复合基因真核表达重组质粒的构建与表达

目的:构建弓形虫SAG1-GRA1复合基因真核表达重组质粒,并观察其在小鼠胚胎成纤维细胞系NIH3T3细胞中的表达。方法:采用聚合酶链反应(PCR)法分别扩增弓形虫SAG1和GRA1基因片段,导入质粒载体pc DNA3.1(+),构建真核表达重组质粒pc DNA3.1(+)-SAG1和pc DNA3.1(+)-GRA1,继而构建重组质粒pc DNA3.1(+)-SAG1-GRA1;设pc DNA3.1(+)-SAG1-GRA1为实验组、pc DNA3.1(+)为对照组分别转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光染色法鉴定其在NIH3T3细胞中的表达。结果:限制性内切酶双酶切及DNA测序分析结果显示,插入pc DNA3.1(+)的片段分别为1008 bp、570 bp和1578 bp,与预期的SAG1、GRA1和SAG1-GRA1复合基因分子大小相当、序列一致;免疫荧光染色法结果显示,转染重组质粒pc DNA3.1(+)-SAG1-GRA1的NIH3T3细胞内观察到较强的绿色荧光,而转染pc DNA3.1(+)的NIH3T3细胞内未见绿色荧光。结论:成功构建了弓形虫SAG1-GRA1复合基因真核表达重组质粒pc DNA3.1(+)-SAG1-GRA1,且该重组质粒携带的SAG1-GRA1复合基因在NIH3T3细胞中获得表达。

京海黄鸡钠氢离子交换泵1基因实时荧光定量PCR标准曲线的建立

为阐明钠氢离子交换泵1(Na+/H+exchanger 1,NHE1)基因在京海黄鸡组织表达和生理功能,依据GenBank登录的NHE1基因的核苷酸序列(登录号:DQ256198)设计特异性引物,经RT-PCR技术从京海黄鸡组织样中扩增和克隆了上述因子的204bp核苷酸片段。测序鉴定后,将重组质粒10倍系列稀释后作为标准模板,通过实时荧光定量PCR方法,建立了它们各自的标准曲线及直线回归方程,得到了相关系数R2=0.9903、回归方程为y=-3.4643x+35.9000的标准曲线,成功构建了NHE1基因的标准质粒和标准曲线,为京海黄鸡组织中NHE1mRNA水平的定量检测提供了必要的技术手段。

pEgr-ssEndostatin的构建及其在体外的辐射诱导表达

为探讨 pEgr-ssEndostatin 重组质粒转染 B16 细胞后接受不同辐射剂量以及接受同一剂量不同时程endostatin 表达的规律。采用 RT-PCR 方法从鼠肝脏中扩增出 Endostatin cDNA,连入信号肽,构建了pEgr?ssEndostatin 重组质粒,用脂质体介导的转染法转染小鼠 B16 细胞,用 ELISA 方法检测 B16 细胞上清中endostatin 的表达水平。结果表明的分泌型 Endostatin 序列与报道完全一致,Egr-1 启动子和 Endostatin cDNA正确插入表达载体 pcDNA3.1;pEfr-ssEndostatin 具有辐射诱导表达特性。提示小鼠 Endostatin 基因成功地被克隆和表达,Egr-1 启动子具有辐射激活和诱导下游基因表达增强的功能。

脂质体包裹人促甲状腺激素受体胞外段基因真核表达质粒的构建

目的:构建阳离子脂质体包裹的人促甲状腺激素受体胞外段基因真核表达质粒。方法:PCR扩增穿梭质粒PHMCMVTSHR289目的基因并连接于真核表达质粒pcD NA3.1+上,重组质粒pcD NA3.1+/TSHR289采用酶切及测序法鉴定。阳离子脂质体包裹重组质粒pcD NA3.1+/TSHR289。结果:重组质粒pcD NA3.1+/TSHR289用Hind III酶切后产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测显示出现512bp条带。正向测序发现AAC突变为AAT,为同义突变。反向测序发现GCG突变为GCT,亦为同义突变。阳离子脂质体与重组质粒的体积质量比例为3∶1。结论:酶切及测序鉴定重组质粒pcD NA3.1+/TSHR289构建成功。

人脂蛋白脂酶基因重组质粒的构建及其表达

目的研究野生型人脂蛋白脂酶(LPL)cDNA重组表达质粒的构建了及其在COS-1细胞中的表达。方法采用RT-PCR法从人大网膜脂肪组织获取LPL cDNA基因,以pcDNA3.1Zeo(+)质粒作为载体,运用基因克隆技术构建野生型人LPLcDNA重组质粒,限制性内切酶酶切、PCR以及双向测序鉴定重组质粒;运用L ipofectam ine 2000TM将重组pcDNA3.1Zeo(+)-LPLcDNA质粒导入COS-1细胞,RT-PCR法检测LPL mRNA,ELISA法和比色法分别检测细胞裂解液及细胞培养基中LPL浓度及活性。结果经限制性内切酶酶切及PCR鉴定,证实LPL基因已被连接到pcDNA3.1Zeo(+)质粒中;DNA双向测序证实其产物与基因库中LPL基因序列完全一致。LPL mRNA和蛋白表达及其活性测定结果表明,pcDNA3.1Zeo(+)-LPL cDNA重组质粒已转染入COS-1细胞中。结论实验成功构建野生型人LPL cDNA重组表达质粒,并证实其能在COS-1细胞中有效表达。

SIRT1及其突变体T200I、E420K真核表达载体的构建及鉴定

目的 克隆沉默信息调节因子1（SIRTl）基因的全长cDNA,构建含有SIRT1基因及其突变体T200I、E420K的重组真核表达载体,为进一步研究SIRT1基因功能奠定基础.方法 采用RT-PCR方法扩增SIRT1基因的全长cDNA,扩增产物通过双酶切将全长cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3.1（＋）,得到pcDNA3.1 （＋）-SIRT1重组质粒;同时采用定点突变法构建其突变体pcDNA3.1 （＋）-T200I和pcDNA3.1（＋）-E420K表达载体.重组质粒经酶切鉴定和DNA序列测定,筛选出重组成功的真核表达载体.结果 成功克隆了SIRT1基因全长cDNA,并成功构建了pcDNA3.1 （＋）-SIRT1及其突变体的真核表达载体;阳性重组质粒酶切后经测序比对鉴定,与预期序列完全相符,转染293T细胞后可以表达带有HIS标签的SIRT1蛋白.结论 此方法可成功构建重组质粒pcDNA3.1（＋）-SIRT1及其突变体pcDNA3.1（＋）-T200I、pcDNA3.1（＋）-E420K真核表达载体,为SIRT1基因及其突变体T200I、E420K的生物学功能研究提供了基因材料.

人抗氧化蛋白-1在大肠杆菌中的表达、纯化及活性鉴定

为得到较纯的具有活性的人抗氧化蛋白Peroxiredoxin1(Prx1),本文先用PCR的方法扩增了人Prx1的cDNA序列,然后将其连接到pET28表达载体上,从而构建了编码全长的人抗氧化蛋白-1基因的pET28-Prx1原核表达质粒。经双酶切及测序鉴定后将表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,并通过SDS-PAGE和western blot来鉴定表达产物。随后用Ni-NTA螯合亲和层析的方法纯化重组蛋白,并测定该酶的米氏常数,用质粒保护实验鉴定该蛋白其活性。最终表达载体经酶切和测序鉴定证实构建成功,表达产物在SDS-PAGE和western blot图的25 kD左右,与prx1真实的蛋白分子量相符,说明Prx1蛋白成功表达。Prx1纯化后产量达到7.59 mg/g菌体,纯度达到88.50%。纯化后的Prx1在37℃和pH 7.4的条件下催化H2O2反应的米氏常数Km为2.06×10-4 mol/L,质粒保护实验表明Prx1可以保护pUC18质粒免受氧化损伤。因此,Prx1在大肠杆菌中成功表达并得到较纯的活性蛋白。

小鼠pEGFP-Hoxa11真核表达载体的构建及表达

目的 构建和鉴定Hoxa11和EGFP双基因共表达真核载体.方法 采用DNA重组技术,将目的 基因Hoxa11克隆至含有报告基因EGFP的pEGFP-N1真核表达载体中,构建的真核表达载体pEGFP-Hoxa11经PCR,双酶切及基因测序鉴定;转染至CHO细胞,荧光显微镜下观察重组质粒的表达,提取细胞蛋白Western印迹检测蛋白表达.结果 pEGFP-Hoxa11重组质粒构建成功.构建的真核表达载体pEGFP-Hoxa11能在CHO细胞中有效表达.结论 成功构建了共表达Hoxa11和EGFP的真核表达载体,并能在CHO细胞中有效表达.为进一步研究Hoxa11的功能提供实验基础.

两种人源性doc1基因真核表达重组质粒的构建及表达

目的:构建p12蛋白真核表达重组载体,为基因治疗口腔癌提供基础研究。方法:反转录-聚合酶链式反应克隆出doc1基因ORF读框,两端连入酶切位点,导入真核表达载体pT7-FLAG-4及pEGFP-N1。结果:重组子pT7-FLAG-4-doc1及pEGFP-N1-doc1经限制性酶切分析,PCR鉴定和序列测定为正确重组质粒。结论:成功构建p12蛋白真核表达重组质粒pT7-FLAG-4-doc1及pEGFP-N1-doc1,为今后瞬时和稳定转染细胞提供基础。