TGF-β潜态相关肽编码序列的原核表达载体构建及表达产物的纯化与鉴定

转化生长因子β(TGF-β)是促肝纤维的细胞因子,TGF-β潜态相关肽(LAP)和TGF-β的活化有关。本研究提取人血液中总RNA,逆转录转为c DNA,以此为模板PCR目的片段,构建原核表达载体pET28a-LAP-B、pET28a-LAP-F,并在不同诱导温度、IPTG浓度、诱导时机下进行诱导表达,筛选最佳诱导条件,通过镍琼脂糖亲和层析纯化重组蛋白,获得的蛋白通过SDS-PAGE及Western blot鉴定,并检测重组蛋白的浓度。结果表明,LAP全长及截短型原核表达载体构建成功,筛选最佳诱导条件为37℃培养4 h,OD_(600)值为0.8时降温至16℃,加入0.3 mmol/L(LAP-B)/0.45 mmol/L(LAP-F)IPTG诱导16 h,大量培养后通过镍柱纯化和透析得到重组蛋白,经SDS-PAGE及Western blot鉴定为LAP全长及截短型重组蛋白,并测得LAP-B、LAP-F重组蛋白浓度分别为637.6μg/mL、126.6μg/m L。本实验成功得到LAP全长及截短型重组蛋白,为研究LAP对TGF-β促纤维化作用的影响提供了实验基础。