肺康颗粒对COPD大鼠miRNA-21、TGF-β/Wnt-5a信号通路的影响及机制

目的基于微小核糖核酸(miR)-21调控转录生长因子-β(TGF-β)/无翅和整合位点生长因子5a(Wnt-5a)信号通路,探讨肺康颗粒干预慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠炎症的机制。方法将90只SD大鼠随机分成6组:空白对照组、模型组、地塞米松组及肺康颗粒低、中、高剂量组。采用烟熏加气管内注入内毒素法建立大鼠COPD模型。第5周开始给予肺康颗粒灌胃干预,连续给药16周。肺功能检测仪检测大鼠用力肺活量(FVC)、第0.3秒用力呼气容积(FEV0.3)、第0.3秒用力呼气容积与用力肺活量的比(FEV0.3/FVC%)。酶联免疫吸附法(ELISA)测定大鼠血浆、支气管肺泡灌洗液(BALF)炎症细胞因子转录生长因子-β、白细胞介素(IL)-8、IL-17A含量;qRT-PCR法检测肺组织中miRNA-21、Wnt-5a、TGF-βmRNA表达。结果与空白对照组比较,模型组、地塞米松组及肺康颗粒各剂量组大鼠FEV0.3、FVC以及FEV0.3/FVC均显著下降(P<0.05);与模型组比较,肺康颗粒各剂量组的TGF-β、IL-8、IL-17A含量明显降低(P<0.01);肺康颗粒各剂量组的miR-21、Wnt-5a mRNA、TGF-β表达明显下调(P<0.01)。结论肺康颗粒可能通过TGF-β/Wnt-5a信号转导通路干预miR-21炎症基因的表达,减轻COPD大鼠的炎症反应。

基于miRNA21-5p调控TGF-β1/Smads信号通路探讨苓桂气化方抗射血分数保留心力衰竭心肌纤维化的机制

目的基于miRNA21-5p调控转化生长因子-β1(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)/Smads信号通路探讨苓桂气化方抗射血分数保留心力衰竭(heart failure with preserved ejection fraction,HFpEF)心肌纤维化的机制。方法40只4周龄自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)平均分为HFpEF组、沙库巴曲缬沙坦组(LCZ696,0.018 g·kg^(-1))、苓桂气化方低剂量组(LGQH-L,3.87 g·kg^(-1))和苓桂气化方高剂量组(LGQH-H,7.74 g·kg^(-1)),给予高脂、高盐及高糖饮食16周及腹腔注射链脲霉素溶液8周建立HFpEF大鼠模型。10只威斯塔京都(Wistar Kyoto,WKY)大鼠和10只SHR大鼠作为对照组,以普通饲料喂养至实验结束。造模成功后,WKY、SHR和HFpEF组给予等剂量生理盐水,其他3组按照预先规定的干预措施,每天灌胃1次,持续6周。干预结束后,行超声心动图测量左心室(left ventricle,LV)前壁厚度(LV end-diastolic anterior wall thickness,LVAWd)、LV后壁厚度(LV end-diastolic posterior wall thickness,LVPWd)、LV舒张末内径(LV end-diastolic internal diameter,LVIDd)、LV射血分数(LV ejection fraction,LVEF)、LV舒张早期二尖瓣流入峰值速度(E)、舒张晚期二尖瓣流入峰值速度(A)和LV舒张早期二尖瓣环运动速度(e'),并计算E/A和E/e';酶联免疫吸附试验检测血清心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、B型利钠肽(B-type brain natriuretic peptide,BNP)及半乳糖凝集素3(Galectin-3,Gal-3);病理切片进行苏木精伊红及马松染色观察心肌肥厚及纤维化,并计算LV室壁厚度(LV wall thickness,LVWT)、胶原体积分数(collagen volume fraction,CVF)及血管周围纤维化比率(perivascular fibrosis ratio,PFR);实时定量聚合酶链反应检测LV心肌miRNA21-5p及TGF-β1/Smads信号通路相关mRNA表达;蛋白印迹检测LV心肌TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白表达。结果与对照组比较,HFpEF组的LVAWd、LVPWd、LVIDd、E/A、E/e'、ANP、BNP、Gal-3、LVWT、CVF和PFR显著升高(P<0.05或P<0.01);LV心肌miR-NA21-5,α-SMA、CollⅠ、CollⅢ、TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达和α-SMA、CollⅠ、CollⅢ、TGF-β1、P-Smad2/3蛋白表达显著上调(P<0.05或P<0.01);Smad7 mRNA及蛋白表达显著下调(P<0.05或P<0.01)。与HFpEF组比较,苓桂气化方呈剂量依赖性减少LVAWd、LVPWd、LVIDd、E/A、E/e'、ANP、BNP、Gal-3、LVWT、CVF和PFR(P<0.05或P<0.01);下调miRNA21-5p,α-SMA、CollⅠ、CollⅢ、TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达和α-SMA、CollⅠ、GF-β1、P-Smad2/3蛋白表达(P<0.05或P<0.01);上调Smad7 mRNA及蛋白表达(P<0.05或P<0.01)。结论苓桂气化方可能通过靶向miRNA21-5p调控TGF-β1/Smads信号通路抑制心肌纤维化,从而减轻HFpEF大鼠LV重塑和舒张功能障碍,是治疗HFpEF的有效中药复方。

Wnt信号通路成分Wnt-5a和β-连接蛋白在卵巢癌组织中的表达及意义

目的探讨Wnt信号通路成分Wnt-5a和β-连接蛋白(β-catenin)在卵巢癌发生、发展中的作用。方法应用免疫组织化学二步法检测60份卵巢癌组织中Wnt-5a和β-catenin表达;分析其表达与卵巢癌临床病理特征、预后的关系以及两者表达的相关性。结果 Wnt-5a在卵巢癌组织中阳性表达率为61.7%(37/60),其阳性表达与卵巢癌患者年龄、肿瘤大小、组织学类型、病理分级无明显相关性(P均>0.05),与肿瘤转移相关(P<0.05)。β-catenin在卵巢癌组织中阳性表达率为71.7%(43/60),其阳性表达与肿瘤的分期和转移相关(P均<0.05)。Wnt-5a和β-catenin阳性表达患者生存时间明显低于阴性表达患者(P<0.05)。Spearman法分析显示两者表达呈正相关(r=0.344,P=0.011)。在发生转移的患者中Wnt-5a与β-catenin共同阳性表达率高达70%(24/34)。结论 Wnt-5a和β-catenin通过非经典和经典Wnt通路在卵巢癌发展中发挥重要作用,两者高表达可能协同促进肿瘤转移,提示预后不良。

益气解毒方通过TGF-β1/SMAD3信号通路抑制鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭

目的研究益气解毒方对鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响,并从转化生长因子β1(TGF-β1)/SMAD3信号通路探讨其对增殖、迁移和侵袭的作用机制。方法(1)将鼻咽癌细胞分为4组:溶剂对照组、益气解毒方0.5 mg·mL^(-1)组、益气解毒方1.0 mg·mL^(-1)组、5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-Fu)2μg·mL^(-1)组,采用实时无标记细胞功能分析仪(real time cellular analysis technology,RTCA)监测细胞增殖;创伤愈合实验检测细胞迁移;药物干预24 h后,侵袭小室法检测细胞侵袭;Western Blot法检测细胞β-catenin、E-cadherin、N-cadherin、TGF-β1、SMAD3蛋白的表达水平。(2)将鼻咽癌细胞分为5组:溶剂对照组、TGF-β110 ng·mL^(-1)组、TGF-β110 ng·mL^(-1)+益气解毒方1.0 mg·mL^(-1)组、益气解毒方1.0 mg·mL^(-1)组、LY320088210μmol·L-1组,采用实时无标记细胞功能分析仪监测细胞增殖;创伤愈合实验检测细胞迁移;药物干预24 h后,侵袭小室法检测细胞侵袭;Western Blot法检测细胞β-catenin、E-cadherin、N-cadherin、TGF-β1、SMAD3蛋白的表达水平。(3)随机将裸鼠分为模型组、益气解毒方组和5-Fu组。皮下部位注射细胞悬液制备鼻咽癌裸鼠移植瘤模型,基本成瘤后,5-Fu组每2 d腹腔注射1次,其余组每天灌胃给药1次,连续3周。每隔3 d测量瘤体体积1次;Western Blot法检测各组组织中β-catenin、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达水平。结果与溶剂对照组比较,益气解毒方(0.5、1.0 mg·mL^(-1))组的细胞增殖曲线均下降,细胞迁移和侵袭能力均降低(P<0.05,P<0.01),且E-cadherin蛋白表达明显升高(P<0.01),β-catenin、N-cadherin、TGF-β1、SMAD3蛋白表达均明显降低(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,益气解毒方组的鼻咽癌移植瘤体积明显减小(P<0.05),且益气解毒方组移植瘤组织中的β-catenin和N-cadherin蛋白表达明显下调(P<0.05,P<0.01),E-cadherin蛋白表达明显上调(P<0.01)。加入TGF-β1信号通路激活剂和抑制剂后,与益气解毒方1.0 mg·mL^(-1)组比较,TGF-β110 ng·mL^(-1)+益气解毒方1.0 mg·mL^(-1)组的TGF-β1、SMAD3、β-catenin和N-cadherin蛋白表达水平均明显升高(P<0.05,P<0.01),且细胞增殖、迁移和侵袭的能力明显增强(P<0.01)。结论益气解毒方能够通过调控TGF-β1/SMAD3信号通路抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

温阳消癥方对5/6肾切除小鼠肾纤维化的保护作用及对TGF-β1/Smad3信号通路的影响

[目的]观察温阳消癥方对5/6肾切除小鼠肾功能、肾脏病理、纤维化指标及转化生长因子-β_(1)(transforming growth factor-β_(1),TGF-β_(1))/Smad3通路的影响,探讨该方对肾纤维化的保护作用及可能的机制。[方法]40只C57BL/6小鼠中随机选取10只作为假手术组,30只制作5/6肾切除模型,造模2周后测血清肌酐,确定造模成功,并将造模组随机分为温阳消癥组、缬沙坦组、模型组。温阳消癥组予温阳消癥方灌胃,缬沙坦组予缬沙坦灌胃,模型组与假手术组予等体积0.9%氯化钠注射液灌胃,给药8周后测定血清肌酐、尿素氮,苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)及Masson染色观察肾脏病理学改变,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,Real-time qPCR)和免疫印迹法检测肾组织α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、纤维连接蛋白(fibronectin,FN)、TGF-β_(1)、Smad3的mRNA和蛋白表达。[结果]与假手术组比较,模型组肾脏纤维化改变明显,血清肌酐、尿素氮、胶原染色阳性率及α-SMA、FN、TGF-β_(1)、Smad3的mRNA和蛋白表达均显著升高(P<0.01)。与模型组比较,温阳消癥组和缬沙坦组小鼠的肾脏病理纤维化形态改变较轻,血清肌酐、尿素氮、胶原染色阳性率,α-SMA、FN、TGF-β_(1)的mRNA和蛋白表达,Smad3蛋白表达均显著降低(P<0.01);Smad3 mRNA表达降低(P<0.01,P<0.05)。与缬沙坦组比较,温阳消癥组的α-SMA mRNA和蛋白表达,以及TGF-β_(1) mRNA表达显著降低(P<0.01);胶原染色阳性率和FN mRNA表达降低(P<0.05)。[结论]温阳消癥方可改善5/6肾切除小鼠肾功能,减轻病理改变,下调肾纤维化标志物α-SMA及FN的表达,减轻细胞外基质(extracellular matrix,ECM)异常堆积,其机制可能与抑制TGF-β_(1)/Smad3信号通路有关。

5-氨基酮戊酸光动力疗法对增生性瘢痕成纤维细胞TGF-β_(1)/Smads信号通路的影响

目的:探究5-氨基酮戊酸光动力疗法(5-ALA-PDT)对增生性瘢痕成纤维细胞转化生长因子-β1(TGF-β1)/Smads信号通路的影响。方法:选取2020年1月至2022年8月收治的增生性瘢痕患者66例进行研究,将其均分为两组,其中对照组给予单纯激光治疗,研究组给予5-ALA-PDT治疗,同时对两组均进行瘢痕组织成纤维细胞培养。比较治疗后两组瘢痕组织成纤维细胞的增殖情况,同时观察不同浓度5-氨基酮戊酸(5-ALA)对瘢痕组织成纤维细胞前胶原mRNA表达的影响,并总结5-ALA对MAPK信号通路中ERK、JNK和P38的影响。结果:(1)研究组不同浓度5-ALA下成纤维细胞的增殖能力均低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)(2)研究组不同浓度5-ALA对成纤维细胞前胶原(包括Ⅰ前胶原/β-actin、Ⅲ前胶原/β-actin)mRNA表达的影响不同,且均低于对照组(P<0.05)。(3)通过体外细胞培养,给予不同浓度5-ALA测定发现,0.5 mmol/L、1.0 mmol/L浓度的5-ALA对TGF-β_(1)的分泌起到了抑制作用,对基质金属蛋白酶1(MMP-1)的分泌起到了诱导作用。(4)研究组中,观察到MAPK家族的信号在0.5 mmo/L时明显增强,与对照组相比,ERK(44 ku)、P38(38 ku)和JNK(46 ku)分别增加了113.0%、36.0%和67.0%(P<0.05)。结论:采用5-ALA-PDT治疗增生性瘢痕可取得一定的成效。5-ALA-PDT可通过抑制Ⅰ型和Ⅲ型前胶原蛋白基因的合成来抑制增生性瘢痕中成纤维细胞的增殖,并对TGF-β_(1)起到抑制作用,对MMP-1起到诱导作用,同时观察到MAPK信号通路在浓度为0.5 mmo/L的5-ALA下增强,该浓度可作为5-ALA-PDT治疗增生性瘢痕的参考浓度。

百令胶囊上调miR-145-5p逆转TGF-β_(1)/Smad3通路机制初探

目的探讨百令胶囊(BLC)对慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠肺损伤的改善作用,以及对香烟烟雾提取物(CSE)作用下人支气管上皮细胞BEAS-2B生长的影响。方法将60只SD大鼠随机分为正常对照组(A组,灌胃生理盐水2 mL),模型组(B组,灌胃生理盐水2 mL),BLC组(C组,灌胃BLC 5.5 mg/kg),miR-145-5p inhibitorNC组(D组,灌胃BLC 5.5 mg/kg+尾静脉注射miR-145-5p inhibitorNC 6μL),miR-145-5p inhibitor组(E组,灌胃BLC 5.5 mg/kg+尾静脉注射miR-145-5p inhibitor 6μL),各12只。以香烟烟雾吸入法复制大鼠COPD模型。建模成功后灌胃相应药物或生理盐水(每日1次),尾静脉注射相应药物(每周1次),连续8周。以0(空白对照),3%,5%,10%,20%CSE,以及加5%,10%,20%,40%的BLC药物血清(BLC-S)孵育细胞48 h。检测大鼠潮气量(TV)、呼气峰流量(PEF)、分钟通气量(MV)、用力肺活量(FVC)和第0.3秒用力呼气容积(FEV_(0.3));观察肺组织病理形态;免疫组化法检测Smad3表达水平,用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定转化生长因子(TGF)-β_(1)表达水平,采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)法检测miR-145-5p mRNA表达水平。采用CCK-8法检测细胞活力。结果与B组比较,C组及D组大鼠TV,PEF,MV,FVC,FEV0.3均显著升高;与D组比较,E组大鼠上述指标均显著降低(P<0.05)。与B组比较,C组及D组大鼠肺组织病理形态显著改善,平均肺泡数显著增加,肺泡直径显著减小;与D组比较,E组大鼠肺组织病理形态未改善,且平均肺泡数显著减少,肺泡直径显著增长(P<0.05)。与5%CSE条件比较,5%CSE+20%BLC-S条件下的细胞活力显著增强(P<0.05)。与B组比较,C组及D组大鼠肺组织中Smad3,TGF-β_(1)的表达水平均显著降低,miR-145-5p mRNA表达水平显著升高(P<0.05);与D组比较,E组大鼠肺组织中Smad3,TGF-β_(1)的表达水平均显著升高,miR-145-5p mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。与5%CSE条件比较,5%CSE+20%BLC-S条件下细胞Smad3和TGF-β_(1)的表达水平均显著降低,miR-145-5p mRNA表达水平显著升高(P<0.05);与5%CSE+20%BLC-S+inhibitor NC条件比较,同水平inhibitor条件下细胞Smad3及TGF-β_(1)表达水平均显著升高(P<0.05)。结论BLC在体内和体外均显示出对香烟诱导COPD的保护作用,其机制可能与上调miR-145-5p水平逆转香烟暴露激活的TGF-β_(1)/Smad3信号通路有关。

miR-140-5p靶向调控HAND2影响TGF-β1诱导肾小管上皮细胞生长

目的探讨miR-140-5p调控心脏神经脊衍生物表达转录因子2(HAND2)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导肾小管上皮细胞生长的影响。方法实验设置TGF-β1组、对照(NC)组、miR-NC组、miR-140-5p组、anti-miRNC组、anti-miR-140-5p组、miR-NC+TGF-β1组、miR-140-5p+TGF-β1组、si-NC+TGF-β1组、si-HAND2+TGF-β1组、miR-140-5p+pcDNA-NC+TGF-β1组、miR-140-5p+pcDNA-HAND2+TGF-β1组。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-140-5p和HAND2 mRNA表达水平;蛋白质印迹(Western blot)法检测HAND2、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cleaved-caspase-3)、磷酸化磷脂酰肌醇3激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)蛋白表达;四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞增殖率;流式细胞术检测细胞凋亡;双荧光素酶报告实验验证miR-140-5p和HAND2的靶向关系。结果TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞中miR-140-5p低表达,HAND2高表达。高表达miR-140-5p或低表达HAND2,TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞中CyclinD1表达水平升高,Cleaved-caspase-3表达水平降低,细胞增殖率升高,细胞凋亡率降低(P<0.05)。miR-140-5p靶向调控HAND2,高表达HAND2可以逆转miR-140-5p对TGF-β1处理的肾小管上皮细胞增殖和凋亡的影响。高表达miR-140-5p,p-PI3K、p-AKT表达水平升高;而高表达HAND2逆转了miR-140-5p对PI3K/AKT信号通路的促进作用。结论过表达miR-140-5p通过靶向下调HAND2激活PI3K/AKT信号通路促进肾小管上皮细胞增殖,抑制响TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞凋亡。

SLC7A5对肿瘤细胞增殖的影响及其与转化生长因子-β1信号调控的关系

目的:研究氨基酸转运载体基因SLC7A5(solute carrier family 7,member 5)在肿瘤细胞中发挥的生物学效应及其转录调控机制。方法:利用基因表达综合(Gene Expression Omnibus,GEO)数据库分析SLC7A5在人正常组织和相应的肿瘤组织中的表达情况;构建SLC7A5基因的重组质粒,采用噻唑蓝(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)比色法、流式细胞仪技术检测该基因对肿瘤细胞增殖的影响;通过生物信息学方法分析SLC7A5基因启动子及其转录因子结合位点,构建该基因的启动子质粒,并利用荧光素酶报告基因系统、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)探讨转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)对SLC7A5基因的表达调控。结果:GEO数据库分析显示SLC7A5的分布具有组织特异性,且在大多数的肿瘤组织中的表达水平明显高于相应的正常组织;MTT比色法、流式细胞仪检测结果表明SLC7A5具有促进细胞增殖的作用;通过启动子分析、载体构建、报告基因检测和RT-PCR实验证实TGF-β1可上调SLC7A5启动子的活性,从而促进该基因的表达。结论:SLC7A5基因在肿瘤细胞中发挥促癌作用,且受TGF-β1信号通路的调控。

HES5对肾小管上皮细胞转分化和凋亡的影响及其机制研究

目的探讨HES5(hairy and enhancer of split 5)对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化和凋亡的作用及其潜在机制。方法分析和筛选GSE66494数据中的差异表达基因。建立小鼠的输尿管梗阻模型(unilateral uretera obstruction,UUO),检测肾组织中HES5的表达水平。TGF-β1(10 ng/mL)处理HK-2细胞24 h建立肾小管上皮-间质转化模型后,通过qRT-PCR和Western blot检测HES5的表达水平。用过表达HES5的质粒转染HK-2细胞,24 h后检测其纤连蛋白(Fibronectin,FN)、胶原蛋白Ⅰ(CollagenⅠ)和波形蛋白(Vimentin)及凋亡相关标志物(Bax、Bcl2)等蛋白表达;然后,将HK-2细胞分为4组:Control组、siHES5组、TGF-β1组、siHES5+TGF-β1组,检测各组的纤维化及凋亡标志物的表达情况。运用TUNEL及流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况。Western blot检测各组AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K的蛋白表达。通过加入PI3K抑制剂(LY294002)处理过表达HES5的HK-2细胞后,检测Vimentin的表达。结果HES5的表达在慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)和小鼠纤维化肾组织中均显著上调;过表达HES5可以促进HK-2细胞中FN、CollagenⅠ、Vimentin、Bax的合成,抑制Bcl2的表达(P<0.05);敲低HES5不仅下调纤维化标志物的表达,还抑制了肾小管上皮细胞凋亡;此外,HES5基因敲低使TGF-β1诱导的HK-2细胞内PI3K/AKT信号通路的激活程度降低(P<0.05);PI3K/AKT信号通路抑制剂减弱了HES5对Vimentin的诱导作用。结论敲低HES5可以抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化和凋亡,这可能与PI3K/AKT信号通路活性降低有关。

Wnt-5a、Wnt-11、CaMKⅡ在良性转归葡萄胎和恶性变葡萄胎中的表达及意义

目的探讨无翅型MMTV整合位点家族成员5a(Wnt-5a)、无翅型MMTV整合位点家族成员(Wnt-11)及Ca~(2+)/钙调素依赖的蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)在良性转归及恶性变葡萄胎组织中的表达其临床意义。方法收集2009年3月至2020年3月本院72例葡萄胎患者首次清宫石蜡标本,其中28例为随访发生恶变的葡萄胎(恶变葡萄胎组),44例为随访未发生恶变的葡萄胎(良性转归葡萄胎组),采用免疫组织化学法(IHC)检测上述组织标本中Wnt-5a、Wnt-11及CaMKⅡ蛋白表达情况;采用ROC曲线分析Wnt-5a、Wnt-11及CaMKⅡ蛋白表达对葡萄胎恶变的预测效能。结果恶变葡萄胎组和良性转归葡萄胎组的Wnt-5a(75.00%vs 29.55%)、Wnt-11(82.14%vs 22.13%)及CaMKⅡ(89.29%vs 63.64%)蛋白阳性表达率比较,恶变葡萄胎组均显著高于良性转归葡萄胎组,差异有统计学意义(P<0.05)。多因素Logistic回归结果提示宫腔病变径线≥6 cm(OR=2.328,95%CI:1.518~3.569)、Wnt-5a阳性(OR=3.347,95%CI:1.586~7.062)、Wnt-11阳性(OR=3.873,95%CI:1.664~9.014)及CaMKⅡ阳性(OR=1.355,95%CI:1.057~1.738)是葡萄胎恶变的独立危险因素(P<0.05)。Wnt-11预测葡萄胎恶变的的AUC分别大于宫腔病变径线、CaMKⅡ预测的AUC(P<0.05),与Wnt-5a预测的AUC比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论恶变葡萄胎首次清宫组织中Wnt-5a、Wnt-11及CaMKⅡ蛋白表达较良性转归葡萄胎异常升高,三者对葡萄胎恶变具有较好的预测价值。

miRNA-224-5p通过TGF-β/Smad4信号通路调控甲状腺乳头状癌细胞凋亡

目的探讨miRNA-224-5p通过TGF-β/Smad4信号通路对甲状腺乳头状癌细胞凋亡的调控作用。方法选取2015年7月至2017年11月新疆维吾尔自治区人民医院手术切除所得甲状腺乳头状癌组织及相应的癌旁组织冻存标本各60份。通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测60例甲状腺乳头状癌组织及60例癌旁组织中miRNA-224-5p的相对表达量,二者比较采用配对资料t检验。将miRNA-224-5p(miRNA-224-5p组)与miRNA-224-5p抑制剂(miRNA-224-5p抑制剂组)分别转染到甲状腺乳头状癌细胞株GLAG-66中,通过RT-PCR检测两组中GLAG-66细胞内miRNA-224-5p的相对表达量,应用流式细胞仪检测两组GLAG-66细胞转染48 h后凋亡率,应用Western blot实验检测两组GLAG-66细胞中Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase3、TGF-β1、Smad4蛋白的相对表达量,并采用两个独立样本t检验进行比较。结果 miRNA-224-5p在甲状腺乳头状癌组织中的相对表达量与癌旁组织比较明显升高,差异具有统计学意义[(4.175±0.523)vs(1.236±0.236),t=9.675,P=0.001)]。miRNA-224-5p抑制剂组GLAG-66细胞中miRNA-224-5p的相对表达量与miRNA-224-5p组比较明显下降,差异具有统计学意义[(0.381±0.078)vs(1.000±0.023),t=19.785,P <0.001)]。miRNA-224-5p抑制剂组GLAG-66细胞转染48 h后的凋亡率与miRNA-224-5p组比较明显增高,差异具有统计学意义[(18.66%±0.98%)vs(3.78%±0.36%),t=17.561,P <0.001]。miRNA-224-5p抑制剂组和miRNA-224-5p组比较,GLAG-66细胞中Bcl-2、TGF-β1和Smad4蛋白的相对表达量明显降低,差异具有统计学意义[(0.197±0.008)vs(0.278±0.013),t=8.259,P=0.001;(0.117±0.013)vs(0.227±0.012),t=13.269,P <0.001;(0.268±0.012)vs(0.439±0.016),t=9.897,P=0.001];Bax、Cleaved-Caspase3蛋白的相对表达量明显升高,差异具有统计学意义[(0.286±0.011)vs(0.159±0.009),t=12.569,P <0.001;(0.128±0.009)vs(0.083±0.010),t=7.693,P=0.002]。结论 miRNA-224-5p在甲状腺乳头状癌组织中表达增高,下调miRNA-224-5p可以促进甲状腺乳头状癌细胞的凋亡,其作用机制可能与TGF-β/Smad4信号通路有关。

miR-181a-5p靶向CTDSPL基因调节TGF-β信号通路在胃肠道间质瘤发生、发展中的作用

目的探讨miR-181a-5p靶向羧基末端区域小磷酸化酶样蛋白(carboxy-terminal domainsmall phosphatase-like,CTDSPL)基因介导TGF-β信号通路对胃肠道间质瘤发生发展的影响。方法选择2016年1月至2019年12月于商丘市第一人民医院行手术治疗的胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumor,GIST)患者作为研究对象,术中取患者的肿瘤组织和癌旁正常组织。分析患者的临床病理资料;采用定量实时聚合酶联反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测CTDSPL基因mRNA和miR-181a-5p的表达量;采用western blot法检测CTDSPL基因及TGF-β信号通路相关因子的蛋白表达水平。将人胃肠道间质瘤细胞系(GIST-T1)分别转染miR-181a-5p mimic、miR-181a-5p inhibitor和CTDSPL过表达载体。MTT检测各组细胞增殖活力,Transwell检测各组细胞侵袭,流式细胞术检测各组细胞凋亡。结果相对于癌旁组织,GIST患者的肿瘤组织中miR-181a-5p及TGF-β信号通路相关因子表达增强,CTDSPL表达被抑制。肿瘤大小、浸润深度和改良NIH分级与GIST肿瘤组织CTDSPL基因mRNA表达量有关(P均<0.05)。相对于Blank组,敲除miR-181a-5p或过表达CTDSPL能抑制癌细胞增殖活力和侵袭,诱导细胞凋亡,而miR-181a-5p mimic对GIST-T1细胞的作用能被CTDSPL过表达挽救。结论miR-181a-5p可通过下调CTDSPL基因表达水平,激活TGF-β信号通路促进GIST的发生、发展。

miR-151a-5p对结直肠癌细胞增殖和转移的影响及其机制探讨

目的:研究miR-151a-5p在结直肠癌(colorectal cancer,CRC)细胞中的生物学功能及其潜在机制。方法:采用qRT-PCR检测miR-151a-5p在不同CRC细胞株中的表达情况;使用Lipofectamine^(TM)2000将miR-151a-5p mimics/inhibitor和对照寡核苷酸分别转染至HCT116和SW480细胞中;通过CCK-8、细胞克隆形成实验和Transwell侵袭与迁移实验以及蛋白免疫印迹实验证明miR-151a-5p过表达组和敲低组对CRC细胞功能的影响及机制。结果:qRT-PCR结果显示,miR-151a-5p在HCT116细胞中低表达,在SW480细胞中高表达;CCK-8和细胞克隆形成实验结果显示,HCT116细胞过表达miR-151a-5p后细胞增殖能力明显高于对照组,而SW480细胞敲低miR-151a-5p后结果相反;Transwell实验结果显示,与相应的对照组相比,HCT116-mimics组细胞迁移和侵袭能力均增强,而SW480-inhibitor组细胞迁移和侵袭能力均降低;蛋白免疫印迹结果显示,与对照组相比,HCT116-mimics组E-cadherin和ZO-1蛋白表达水平降低,N-cadherin、Vimentin、β-Catenin、MMP2、MMP9蛋白和TGF-β/Smad信号通路相关蛋白表达水平升高,而SW480-inhibitor组呈相反结果。结论:miR-151a-5能够促进CRC细胞的增殖、侵袭和迁移,其机制可能与促进上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)进程相关,而TGF-β/Smad信号通路相关蛋白在EMT发生进程中出现改变,提示TGF-β/Smad信号通路可能参与了该表型的调控。

温阳消癥方对5/6肾切除小鼠肾纤维化的作用及其机制

目的:观察温阳消癥方对5/6肾切除小鼠残肾功能及肾脏纤维化的影响,并探讨其作用机制。方法:随机从32只小鼠中取24只制作5/6肾切除慢性肾功能衰竭肾纤维化模型,2周后根据血清肌酐值将24只小鼠分为5/6肾切除组、代文组和温阳消癥方组,另8只作为假手术组。治疗8周后,Western blot检测各组小鼠肾组织JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3、转化生长因子β1(TGF-β1)、Smad3、I型胶原蛋白(Col-I)、Ⅲ型胶原蛋白(Col-Ⅲ)、α-SMA蛋白表达水平,免疫组织化学染色法测定小鼠肾组织Col-I、Col-Ⅲ、α-SMA水平,用RT-q PCR法测定TGF-β1、Smad3 mRNA水平。结果:治疗8周后,模型组小鼠肾组织JAK2、STAT3、pJAK2、p-STAT3、TGF-β1、Smad3、Col-I、Col-Ⅲ、α-SMA蛋白表达均较假手术组上调(P<0.01),模型组小鼠肾组织TGF-β1、Smad3 mRNA表达较假手术组上调(P<0.01);与模型组比较,代文组、温阳消癥方组JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3、TGF-β1、Smad3、Col-I、Col-Ⅲ、α-SMA蛋白表达和TGF-β1、Smad3 mRNA表达均下调(P<0.01);与代文组比较,除TGF-β1、α-SMA外,温阳消癥方组其余指标均下调(P<0.01)。结论:温阳消癥方能够保护5/6肾切除小鼠残肾功能,减轻肾纤维化病变程度,其机制可能与抑制TGF-β1/Smad3、JAK2/STAT3通路相关。

miR-1247-5p对Smad2基因的靶向调控作用

目的利用miR-1247-5p过表达模拟物mimics,研究miR-1247-5p对TGF-β信号通路中关键蛋白Smad2的靶向调控作用。方法合成模拟miR-1247-5p过表达的模拟物mimics,及抑制miR-1247-5p表达的抑制物inhibitors;同时构建与miR-1247-5p互补靶基因Smad2的3'非翻译区,将其克隆到线性化的Report荧光报告载体中。将测序鉴定阳性的report-Smad2 3'-UTR重组质粒,与miR-1247-5p的mimics/inhibitors共转染至HEK-293T细胞,通过relative luciferase activity实验验证靶向关系,并通过Western blot实验进一步检测Smad2蛋白表达水平。结果成功构建report-Smad2 3'-UTR重组质粒,Western blot实验表明转染miR-1247-5p mimics组中Smad2蛋白表达下调(P<0.05);而转染miR-1247-5p inhibitors组中,Smad2蛋白表达上调(P<0.05)。结论证实miR-1247-5p直接靶向TGF-β信号通路中关键蛋白Smad2的表达,在蛋白水平对其进行调控,为进一步研究miRNA在细胞通路中的调控作用提供了依据。

FOXM1在高糖诱导的MRC-5细胞胶原合成中的作用

目的探讨转录因子FOXM1在高糖诱导MRC-5细胞胶原合成中的作用。方法①通过CCK8探究MRC-5细胞高糖诱导模型的最适时间和浓度:时间梯度为6、12、24、48、72 h;浓度梯度为5.5、15、30、45 mmol·L^(-1),甘露醇30 mmol·L^(-1)为高渗对照组。②检测高糖诱导对MRC-5细胞胶原合成的影响:将细胞分为正常对照组、高渗对照组(甘露醇30 mmol·L^(-1))和高糖(30 mmol·L^(-1))组,通过Western blot和qPCR法检测胶原合成相关因子(Fn、COLⅠ、COLⅢ、α-SMA、MMP9、TIMP1)和TGF-β信号通路相关因子(TGF-β1、p-Smad2/Smad2)的表达。③探讨FOXM1在高糖促进胶原合成中的作用:将细胞分为正常对照组、高渗对照组(甘露醇30 mmol·L^(-1))、高糖(30 mmol·L^(-1))组和高糖(30 mmol·L^(-1))+硫链丝菌素(1μmol)组,Western blot和qPCR法检测FOXM1和胶原合成相关因子的表达。结果甘露醇对MRC-5细胞增殖没有明显影响,30 mmol·L^(-1)高糖培养MRC-5细胞24 h时,细胞增殖比对照组明显降低;高糖培养MRC-5细胞促进COLⅠ、COLⅢ和FOXM1等因子的表达;加入硫链丝菌素后,FOXM1的表达明显被抑制,胶原合成相关因子的蛋白表达及mRNA水平较高糖组也均有下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论FOXM1是高糖诱导MRC-5细胞胶原合成增加的一个相关因子。

MicroRNA-199b-5p在贝那普利改善自发性高血压大鼠心脏重构中的作用

目的探讨microRNA-199b-5p(miR-199b-5p)在贝那普利改善自发性高血压大鼠(SHR)心脏重构中的作用。方法取10周龄雄性SHR16只,随机分为两组:即SHR干预组和SHR对照组各8只;另取Wistar大鼠8只作为正常对照组即:NC组。SHR干预组:给予10mg/(kg.d)贝那普利灌胃8周;SHR对照组和NC组给予同等剂量蒸馏水灌胃8周。干预前后测量鼠尾动脉血压,测量后麻醉取心脏样本。HE染色、检测miR-199b-5p及TGF-β1、Smad3的表达水平。结果 SHR干预组心肌细胞形态学与NC组无明显差异;两组SHR心脏组织中的miR-199b-5p、TGF-β1、Smad3表达量高于NC组(P<0.01);但SHR干预组较SHR对照组低(P<0.01)。结论贝那普利可能通过抑制miR-199b-5p表达,下调TGF-β1、Smad3蛋白的表达从而改善SHR心脏重构。

姜黄素对食管癌细胞中5-FU化疗敏感性的影响

目的探讨姜黄素对食管癌细胞中5-氟尿嘧啶(5-FU)化疗敏感性的影响。方法选取食管癌细胞EC-9706和EC-109,单独给予5-FU或联合姜黄素干预后,采用CCK-8法检测细胞增殖,RT-qPCR法检测miR-590-3p表达,Western blot法检测Wnt-2、β-catenin蛋白表达。结果姜黄素能够抑制食管癌EC-9706和EC-109细胞的增殖(P<0.05),并呈剂量依赖性。姜黄素能够增强食管癌细胞EC-9706和EC-109对5-FU的敏感性,降低其IC50值(P<0.01)。miR-590-3p在食管癌细胞系中低表达;过表达miR-590-3p能够抑制食管癌细胞的增殖,并增加EC-9706和EC-109细胞对5-FU的敏感性,降低其IC_(50)值(P<0.01)。姜黄素能够增加食管癌细胞中miR-590-3p的表达;抑制miR-590-3p的表达能够逆转姜黄素对食管癌细胞增殖的影响。姜黄素能够通过调节miR-590-3p表达抑制Wnt-2、β-catenin蛋白表达(P<0.01)。结论姜黄素能够增加5-FU对食管癌的化疗敏感性,其机制可能是通过调控miR-590-3p表达从而抑制Wnt-2/β-catenin通路的活性。