截短型潜态相关肽对TGF-β诱导HSC-T6细胞增殖的影响

目的原核表达并纯化重组截短型TGF-β潜态相关肽(latency associated peptide,LAP),观察其对转化生长因子TGF-β(Transforming Growth Factor-β,TGF-β)诱导的大鼠肝星状细胞(Hepatic stellate cell,HSC)增殖的影响。方法LAP各个片段重组蛋白小量培养经IPTG诱导表达,并通过Ni^2+亲和层析纯化,纯化产物进行SDS-PAGE电泳检测。通过MTT法检测浓度分别为2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、64μg/mL LAP-B对TGF-β诱导的HSC-T6细胞增殖作用的影响。结果成功诱导表达可溶性截短型重组蛋白LAP-B,大量培养后经镍柱亲和纯化获得目的蛋白,经SDS-PAGE检测为LAP截短型重组蛋白。MTT检测LAP-B在2~64μg/mL浓度范围内能抑制TGF-β诱导的HSC-T6细胞的增殖,并随着LAP-B蛋白浓度增加HSC-T6细胞增殖抑制越显著。结论成功诱导表达及纯化截短型重组蛋白LAP-B,LAP-B抑制了TGF-β诱导的HSC-T6细胞的增殖,为后续研究LAP的抗肝纤维作用提供实验基础。

潜态相关多肽蛋白在结直肠腺瘤癌变中的作用研究

目的:研究潜态相关多肽(LAP)蛋白在结直肠腺瘤癌变中的作用。方法:收集2016年9月—2017年6月在福建医科大学附属第二医院诊治的健康体检、结直肠腺瘤及结直肠腺癌三组人群的肠组织,运用Western-blot印迹法检测各组织中LAP蛋白的表达水平,进而分析其与临床病理的关系。结果:(1)LAP蛋白的表达水平依次为结直肠腺癌者>结直肠腺瘤者>健康体检者,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)LAP蛋白的表达水平与腺瘤上皮内瘤变的级别、腺癌淋巴结转移及浸润深度呈正相关,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:LAP蛋白对结直肠腺瘤癌变的发生及发展具有促进作用。

重组截短型TGF-β前体潜在相关肽的原核表达及其对HSC-T6细胞增殖的影响

目的初步研究截短型TGF-β前体潜在相关肽(LAP)的重组蛋白对HSC-T6细胞增殖的影响。方法PCR扩增截短型LAP片段,构建该片段的原核表达载体,经双酶切、DNA测序鉴定后,IPTG 0.5 mmol/L,37℃,4 h诱导出蛋白的大量表达,表达的蛋白经SDS-PAGE,Western blot检测,经镍琼脂糖亲和层析纯化重组蛋白,将重组蛋白作用于大鼠肝星状细胞-T6(HSC-T6),用MTT法检测不同浓度重组蛋白对细胞增殖作用的影响。结果原核表达载体构建成功,成功表达、纯化了重组蛋白,且HSC-T6细胞的增殖程度随重组蛋白浓度的增加而降低。结论重组蛋白可抑制HSC-T6细胞的增殖,为后续研究LAP片段对TGF-β活化过程的干扰作用及对器官纤维化的影响奠定基础。

TGF-β潜态相关肽编码序列的原核表达载体构建及表达产物的纯化与鉴定

转化生长因子β(TGF-β)是促肝纤维的细胞因子,TGF-β潜态相关肽(LAP)和TGF-β的活化有关。本研究提取人血液中总RNA,逆转录转为c DNA,以此为模板PCR目的片段,构建原核表达载体pET28a-LAP-B、pET28a-LAP-F,并在不同诱导温度、IPTG浓度、诱导时机下进行诱导表达,筛选最佳诱导条件,通过镍琼脂糖亲和层析纯化重组蛋白,获得的蛋白通过SDS-PAGE及Western blot鉴定,并检测重组蛋白的浓度。结果表明,LAP全长及截短型原核表达载体构建成功,筛选最佳诱导条件为37℃培养4 h,OD_(600)值为0.8时降温至16℃,加入0.3 mmol/L(LAP-B)/0.45 mmol/L(LAP-F)IPTG诱导16 h,大量培养后通过镍柱纯化和透析得到重组蛋白,经SDS-PAGE及Western blot鉴定为LAP全长及截短型重组蛋白,并测得LAP-B、LAP-F重组蛋白浓度分别为637.6μg/mL、126.6μg/m L。本实验成功得到LAP全长及截短型重组蛋白,为研究LAP对TGF-β促纤维化作用的影响提供了实验基础。