益肾散结法对大鼠肾脏间质纤维化组织TGF-β_1和PAI-1表达的影响

目的:观察益肾散结法中药制剂对肾脏间质纤维化及转化生长因子β1(TGF-β_1)和纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)表达的影响。方法:将72只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、治疗组和对照组,采用单侧输尿管结扎复制大鼠肾脏间质纤维化模型,治疗组以肾复康Ⅱ号胶囊颗粒405mg/(kg·d)、对照组以百令胶囊颗粒270mg/(kg·d)灌胃,假手术组及模型组以等体积生理盐水灌胃,于给药后14、21、28d观察模型大鼠肾组织纤维化情况及TGF-β_1和PAI-1的表达情况。结果:治疗组和对照组纤维化程度较模型组明显减轻,TGF-β_1和PAI-1的表达较模型组明显减少。结论:益肾散结法制剂可抑制梗阻侧肾组织中TGF-β_1和PAI-1的表达,对抗肾脏间质纤维化的发生。

真核DNA拓扑异构酶Ⅰ蛋白超家族的进化踪迹分析与全新抗肿瘤药物结合位点的识别

拓扑异构酶Ⅰ(TopoisomeraseⅠ,TopoⅠ)抑制剂已成为新型抗肿瘤药物研究的热点.识别靶酶上全新的药物结合位点对于设计、优化TopoⅠ抑制剂具有重要意义,据此设计的化合物不仅可以创新结构类型,克服现有的喜树碱类药物的毒性,而且有望很好地解决与现有的喜树碱类药物的交叉耐药性问题.通过对真核DNA拓扑异构酶Ⅰ蛋白超家族多元序列联配研究,构建了蛋白质系统进化树,并在此基础上采用进化踪迹分析识别得到了人拓扑异构酶Ⅰ上重要功能残基.研究发现,喜树碱分子7,9位周围存在亚家族特异性的疏水性残基Ala351,Met428,Pro431,表明在喜树碱分子对应区域引入疏水性基团取代,会提高抗肿瘤活性.尤其值得注意的是,超家族保守的蛋白残基Lys436,有望成为新型喜树碱类药物改造的重要靶点,据此设计的新型化合物将有望解决喜树碱类药物水溶性差的问题.此外,突变将导致喜树碱耐药性的蛋白残基Asn352,Arg364为真核TopoⅠ蛋白超家族保守残基,由于对接研究已表明它们均不与喜树碱直接相互作用,因此它们将是发现新型非喜树碱类TopoⅠ抑制剂的重要药物结合位点.

免疫球蛋白超家族——细胞间表面识别结构

免疫球蛋白超家族是一个庞大的蛋白质家族,主要由免疫球蛋白(Ig)、T 细胞抗原受体(TCR)及 MHC Ⅰ、Ⅱ类抗原等组成,它们在结构上与免疫球蛋白有极大的相似性,编码此类蛋白的基因可分为多基因家族和单基因家族,此类蛋白的主要功能是介导细胞间的相互识别,目前对此类蛋白的进化过程尚未完全阐明。

ABCG2食管癌耐药细胞系Eca109/ABCG2的建立

目的探讨腺苷三磷酸结合转运蛋白G超家族成员2(ABCG2)在介导食管癌多药耐药中的作用。方法扩增ABCG2基因,与pcDNA3.1载体连接,构建pcDNA3.1-ABCG2重组质粒,转染Eca109细胞后用G418筛选稳定转染细胞。采用流式细胞术检测细胞内阿霉素的含量,评价细胞对药物的外排作用。MTT法检测阿霉素对Eca109/ABCG2、Eca109/pcDNA3.1、Eca109细胞生长的抑制作用,并计算半数抑制浓度(IC50)和细胞的耐药指数。采用Western blotting和RT-PCR法检测细胞中ABCG2蛋白及mRNA的表达量。结果成功建立转染ABCG2基因的Eca109/ABCG2细胞。Eca109/ABCG2细胞中ABCG2的mRNA和蛋白表达量升高。阿霉素对Eca109/ABCG2、Eca109/pcDNA3.1、Eca109细胞的IC50值分别为18.61±3.94、4.18±0.14、4.69±0.88μg/ml。Eca109/AB-CG2细胞对阿霉素的耐药指数为3.97,且外排阿霉素的作用增强。结论Eca109/ABCG2细胞具有ABCG2的耐药表型,能够稳定表达ABCG2蛋白,可作为研究ABCG2介导的多药耐药相关机制的细胞模型。

细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂-73对肝纤维化的治疗作用及相关机制研究

目的探讨Rab11抑制剂细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂-73(CDKI-73)在肝纤维化中的治疗作用及潜在分子机制。方法将人LX2细胞分成4组:阴性对照组、转化生长因子-β(TGF-β)组、CDKI-73组和TGF-β+CDKI-73组。取15只5周龄雌性C57小鼠,体重(18.04±0.62)g,分成3组,每组5只:对照组(腹腔注射橄榄油+CDKI-73空载体灌胃)、四氯化碳(CCl4)组(腹腔注射CCl4+CDKI-73空载体灌胃)和CCl4+CDKI-73组(腹腔注射CCl4+CDKI-73灌胃)。另取15只5周龄雌性C57小鼠,体重(18.06±0.34)g,分成3组,每组5只:假手术(Sham)组、胆管结扎组(打开腹腔寻找到胆总管并结扎+ CDKI-73空载体灌胃)和胆管结扎+CDKI-73组(打开腹腔寻找到胆总管结扎+CDKI-73灌胃)。蛋白质印迹法检测CDKI-73对LX2细胞以及小鼠肝脏中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)或纤维粘连蛋白(FN)的表达差异;Masson及天狼星红检测CDKI-73处理组及对照组小鼠肝纤维化的不同程度;免疫组化检测不同处理组小鼠肝脏α-SMA的表达差异。结果 CCl4组小鼠天狼星红、Masson染色的胶原生成和免疫组化α-SMA表达相较于对照组均增加(q=38.47、24.99、36.79),而CCl4+CDKI-73组天狼星红、Masson染色的胶原生成和免疫组化α-SMA表达相较于CCl4组的各指标均下降(q=24.72、14.87、27.50),差异均具有统计学意义(均P<0.001)。胆管结扎组天狼星红、Masson染色胶原生成和免疫组化α-SMA表达相较于Sham组均增加(q=28.23、41.01、44.16),而胆管结扎+CDKI-73组天狼星红、Masson染色胶原生成和免疫组化α-SMA表达相较于胆管结扎组的各指标均下降(q=22.88、34.31和33.97),差异有统计学意义(均P<0.001)。TGF-β组α-SMA和FN蛋白相对表达量均高于TGF-β+CDKI-73组(α-SMA:3.71±0.34比1.28±0.31;FN:3.21±0.39比0.83±0.06),差异具有统计学意义(均P<0.001)。TGF-β组α-SMA和FN mRNA相对表达量均高于TGF-β+CDKI-73组的各对应值,差异均具有统计学意义(均P<0.001)。CDKI-73组TGF-β受体Ⅱ蛋白相对表达量高于阴性对照组(4.68±0.63比1.00±0.22),差异有统计学意义(P=0.004)。TGF-β+CDKI-73组磷酸化SMAD2的相对表达量低于TGF-β组(1.67±0.24比3.99±0.44),差异有统计学意义(P<0.001)。Transwell实验结果表明,0.5 μmol/L CDKI-73即可抑制LX2细胞的迁移能力,且随着CDKI-73浓度的增加,抑制能力也越强。结论 CDKI-73在体内和体外均可通过抑制依赖Rab11的TGF-β信号通路,从而抑制肝星状细胞的活化以及肝纤维化的形成。

五倍子酸通过TGF-β/Smads信号通路对人瘢痕成纤维细胞生长抑制效应的初步研究

目的研究五倍子酸对瘢痕疙瘩成纤维细胞的形态、增殖、细胞周期、胶原收缩程度及对转化生长因子β(TGF-β)/Sma和Mad相关蛋白(Smads)信号通路的影响,探讨五倍子酸治疗瘢痕疙瘩的作用及机制。方法2022年8-12月在武汉市第一医院皮肤外科获取术中切除的经临床及病理确诊的瘢痕疙瘩组织标本3份,采用组织块培养法进行原代成纤维细胞培养,取第3~8代细胞进行实验。设置低、中、高剂量五倍子酸组(分别用0.025、0.05、0.1 mg/ml五倍子酸干预细胞)及对照组(仅用含10%胎牛血清的DMEM培养细胞)。培养24、48、72 h后,细胞计数(CCK8)法检测各组细胞增殖活性,三维培养观察胶原收缩情况。按上述分组培养细胞24 h后,在微分干涉倒置荧光显微镜下拍照并使用流式细胞仪分析各组细胞周期变化。使用0.1 mg/ml五倍子酸干预细胞作为实验组(高剂量五倍子酸组),与对照组细胞分别培养24 h后,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定两组TGF-β1、2、3浓度变化,实时荧光定量PCR检测TGF-β1、2、3,Smad2、3、4及α平滑肌肌动蛋白(SMA)mRNA相对表达水平。统计学分析采用t检验、单因素方差分析及两因素方差分析,两两多重比较采用LSD-t检验。结果与对照组相比,随五倍子酸剂量增加,镜下瘢痕疙瘩成纤维细胞形态发生改变,逐渐出现胞体缩小、细胞间距变大、萎缩、凋亡细胞增多现象。CCK8结果显示,随五倍子酸剂量增加及作用时间延长,细胞增殖活力变化显著(F组别=78.31,P<0.001;F时间=4.17,P=0.037),其中高剂量五倍子酸组24、48、72 h时瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖活力均显著低于对照组(均P<0.05)。三维培养显示,随培养时间延长,各组胶原均发生收缩,但收缩程度不同,对照组胶原明显收缩,各浓度五倍子酸组胶原收缩程度较低;作用24、48、72 h,中、高剂量五倍子酸组胶原收缩指数均显著低于对照组(均P<0.05)。流式细胞仪检测显示,处理24 h后,低、中、高剂量五倍子酸组细胞凋亡率(38.68%±3.05%、41.82%±2.19%、43.56%±3.58%)均显著高于对照组(12.58%±1.56%,均P<0.001);与对照组相比,中、高剂量五倍子酸组G0/G1期细胞比例显著较低(均P<0.01),而S期和G2/M期细胞比例则显著较高(均P<0.05)。ELISA结果显示,高剂量五倍子酸组TGF-β1浓度[(758.58±31.42)pg/ml]显著低于对照组[(1081.30±44.72)pg/ml,t=11.81,P<0.001],TGF-β2浓度[(71.05±7.40)pg/ml]与对照组[(76.43±6.51)pg/ml]相比差异无统计学意义(t=1.09,P=0.317),而TGF-β3浓度[(5.70±3.87)pg/ml]高于对照组[(0.00±0.00)pg/ml,t=2.94,P=0.026]。实时荧光定量PCR显示,与对照组相比,高剂量五倍子酸组TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、α-SMA mRNA表达量均较低(均P<0.05),TGF-β3 mRNA表达量较高(t=6.78,P=0.002),而TGF-β2 mRNA表达量无明显变化(t=0.05,P=0.962)。结论五倍子酸可通过改变瘢痕疙瘩成纤维细胞周期,抑制其增殖,促进其凋亡,改变细胞形态,从而减少瘢痕形成及挛缩,其机制可能与抑制TGF-β/Smads信号通路有关。

Smad蛋白与肝纤维化研究新进展

肝星形细胞（HSCs）是产生细胞外基质（EcM）的主要细胞，ECM堆积可导致肝结构改变和肝功能异常。转化生长因子一β（TGF-β）是促进HSC活化、增殖，合成ECM的关键分子，而Smad蛋白是TGF-β重要的胞内效应蛋白，在肝纤维化信号转导中起着重要作用。此文就Smad与肝纤维化关系及以Smad为靶点的肝纤维化潜在的治疗价值方面进行综述。

Smad2／3／4和TCF-β1在先天性巨结肠症组织中的表达

转化生长因子-β（TGF-β）是许多具有共同生物学特性的信号分子组成的大家族，称为TGF-β超家族（transforminggrowthfactor-betasuperfamily），TGF-β1是其中一员。TGF-β1是一类具有多种功能的多肽类生长因子，主要功能是抑制细胞生长，促进基质形成，与多种疾病的发生发展密切相关。

转化生长因子-β受体抑制剂复合物C促进人胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞定向诱导

目的观察转化生长因子-β（TGF—B）受体抑制剂复合物C对人胚胎干细胞（hESC）向视网膜色素上皮（RPE）细胞定向诱导效率的影响。方法将H1hESC分为对照组和实验组。对照组在细胞过度融合后，以去除碱性成纤维细胞生长因子的血清替代物培养体系诱导RPE细胞定向分化。实验组于诱导分化前6d在培养体系中加入1μmol／l复合物C诱导分化第1、3、5周，采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测两组人类配对盒基因（PAX6）、小眼球相关转录因子（MITF）、细胞视黄醛结合蛋白（CRAI。BP）、RPE65mRNA的表达。将hESC来源的RPE（hESC—RPE）细胞分离纯化，采用RT—PCR、蛋白免疫印迹法（Westernblot）和细胞免疫荧光法对纯化的hESC-RPE细胞进行鉴定。结果诱导分化第4周，实验组肉眼可见色素团块，对照组无色素团块出现。将实验组的色素细胞分离纯化后，可见100％的细胞表现为多角形色素化。RT—PCR检测结果显示，实验组PAX6mRNA表达在诱导分化第1、3周显著高于对照组，差异有统计学意义（t=28．498、3．141，P〈0．05）；诱导分化第3、5周，实验组MITF（户8．866、10．111）、CRAlBP（t=5．293、5．394）和RPE65（t=9．263、9．504）的表达均明显高于对照组，差异有统计学意义（P〈0．05）。hESC-RPE细胞PAX6、MITF、CRALBP、RPE65mRNA表达均显著高于hESC（t=9．154、17．284、18．204、44．194）和ARPE-19（t=7．605、16．770、18．190、44．190）细胞，差异有统计学意义（P〈0．05）。Westernblot检测结果显示，hESC-RPE细胞高水平表达RPE标志蛋白PAX6、RPE65。荧光显微镜观察发现，hESC—RPE细胞表达RPE细胞特异性标志蛋白PAX6、紧密连接蛋白-1。结论TGF-I？受体抑制剂复合物C能显著提高hESC向RPE定向诱导效率。