TH基因修饰的胶质细胞脑内移植治疗帕金森病的实验研究

目的 通过exvivo途径 ,利用基因工程化细胞对酪氨酸羟化酶 (TH)基因在治疗帕金森病中的作用进行探讨。方法 将TH基因构建入逆转录病毒载体中 ,再将含重组DNA的病毒上清感染培养的星形胶质细胞移植入PD大鼠脑内 ,了解PD鼠旋转行为的改善情况。结果 TH基因治疗组PD鼠旋转行为改善明显。结论 TH对PD有明显的治疗作用。

GAP-43基因及TH基因治疗帕金森病的实验研究

目的 利用基因工程化细胞及双基因表达的方式对生长相关蛋白质 (Growthassociatedprotein ,GAP 43)基因及酪氨酸羟化酶 (Tyrosinehydroxylase ,TH)基因在治疗帕金森病 (Parkinson’sdisease ,PD)中的作用进行探讨。方法 将GAP 43及TH基因分别构建入逆转录病毒载体中 ,再将含重组DNA的病毒上清感染培养的星形胶质细胞后移植入PD大鼠脑内 ,了解PD鼠旋转行为的改善情况。结果 TH基因治疗组及TH +GAP 43基因治疗组PD鼠旋转行为改善明显 ,GAP 43基因治疗组无明显治疗作用。结论 TH对PD有明显的治疗作用 ,GAP

大鼠TH基因mRNA的合成及其在真核细胞中的表达

目的 :克隆大鼠酪氨酸羟化酶 (tyrosinehydroxylase,TH)基因的核心cDNA序列 ,并在体外合成THmR NA ,观察其在真核细胞中的表达情况。方法 :采用大鼠黒质细胞cDNA为模板 ,设计特定的引物进行PCR扩增并构建真核表达载体pcDNA 3.1/TH ,在体外转录后获得THmRNA。将获得的THmRNA转染到体外培养的NIH 3T3细胞内 ,用免疫组织化学方法和免疫印迹方法检测其表达。结果 :免疫组织化学方法和免疫印迹方法进行检测后显示转染的THmRNA可以在NIH 3T3细胞内表达TH ,时间达到两周。结论 :采用THmRNA对帕金森病进行的基因治疗可能是一条新的和有价值的途径。

TH基因复合杂合突变致多巴反应性肌张力不全1例报告

目的探讨酪氨酸羟化酶缺乏导致的多巴反应性肌张力不全的诊断和治疗。方法回顾分析1例多巴反应性肌张力不全患儿的临床表现、治疗随访经过及基因检测结果。结果患儿,男,2岁4个月,主要临床表现为语言、运动发育出现倒退,体格检查示四肢肌张力减低。基因突变分析示TH exon4 c.457>T;P.(Arg153*)杂合致病突变,遗传自父亲;TH exon 7:c.739 G>A;P.(Gly 247 Ser)杂合致病突变,遗传自母亲,确诊为酪氨酸羟化酶基因突变导致的多巴反应性肌张力不全。予左旋多巴治疗,患儿症状无明显改善,改用多巴丝肼治疗后取得满意疗效。结论对于不明原因的肌张力不全,尤其是婴儿期起病并伴有锥体外束受损为标志的运动功能减退,均应高度怀疑为酪氨酸羟化酶缺乏导致的多巴反应性肌张力不全,基因检测有助于确诊,多巴丝肼效果优于左旋多巴。

微囊化转TH基因人成纤维细胞脑内移植治疗帕金森病大鼠模型的研究

目的 探讨微囊化转酪氨酸羟化酶 (TH)基因的细胞在帕金森病 (PD)大鼠模型脑内存活、组织反应及对异常行为的治疗效果。 方法 以人 TH基因作为目的基因 ,重组到逆转录病毒载体感染人成纤维细胞 ,将细胞包裹在 APA半透膜中进行微囊化后 ,植入 6 -羟多巴胺单侧损毁的 PD大鼠模型纹状体内 ,观察移植物的存活状况和功能作用 16周。 结果 体外和植入体内的微囊化转基因细胞具有良好的存活能力。移植微囊化细胞可以使大鼠异常运动明显改善 ,移植位点周围的免疫反应较小。

TH基因变异致婴儿多巴反应性肌张力障碍4例临床和基因分析

目的探讨婴儿起病的多巴反应性肌张力障碍(DRD)的临床及遗传特征。方法回顾分析2016年4月—2020年6月收治的4例婴儿期起病的DRD患儿的临床资料。结果4例患儿中,男性3例、女性1例,起病年龄2~7个月。临床表现为发育落后或发育倒退,肌无力,肌张力障碍。患儿血生化、血氨、血乳酸无异常;脑电图、头颅磁共振成像(MRI)均无明显异常。患儿常规染色体检查无异常,发现TH基因复合杂合致病性变异。例1变异位点c.457C>T遗传自父亲,c.1196C>T遗传自母亲;例2 c.698G>A遗传自父亲,c.1293+5G>C遗传自母亲;例3 c.880G>C遗传自父亲,c.690C>A遗传自母亲;例4 c.739G>A遗传自父亲,c.1293+5G>C遗传自母亲;均为已报道的致病性变异。例1、2、3患儿确诊后予小剂量多巴丝肼治疗,逐渐加量至获得最佳疗效;随访至今1.5~3年,目前服药最大剂量达20~25 mg/(kg·d),均基本恢复;例4现多巴丝肼用量12 mg/(kg·d),激动时仍有肌张力障碍表现,继续缓慢加量中。结论婴儿起病的DRD早期症状无特殊性,应尽早行遗传学检测,多巴丝肼治疗效果好。

慢病毒介导新型Tet-On系统调控大鼠GDNF和TH双基因表达对帕金森病大鼠的实验研究

目的观察改良Tet-On系统修饰慢病毒(Lv-TH-GDNF)目的基因的表达调控及纹状体内直接转移对帕金森病(PD)大鼠的作用。方法 1用Lv-TH-GDNF与rt TA2s-M2病毒感染He La细胞,免疫印迹法检测强力霉素(Dox)对TH、GDNF基因表达的调控。2用Lv-TH-GDNF与rt TA2sM2病毒共同注射到PD大鼠患侧纹状体,Dox诱导目的基因表达。通过观察阿扑吗啡(APO)诱导旋转行为、黑质多巴胺能神经元数量、患侧纹状体DA、DOPAC含量评估Lv-THGDNF治疗效应;通过移植侧纹状体内TH与GDNF蛋白量评估外源基因在体内的表达。结果 1在体外He La细胞实验,仅Dox阳性组见TH、GDNF蛋白条带。2在动物体内实验,病毒移植4周后,与PBS对照组相比,仅病毒+Dox组大鼠旋转行为明显改善(P<0.01),损伤侧黑质致密部TH阳性细胞数、纹状体DA、DOPAC含量及TH和GDNF蛋白量明显增高(P<0.01)。结论新型Tet-On系统修饰的Lv-THGDNF目的基因表达受四环素类抗生素调控,在体外实验未见基础活动,且纹状体内直接转移对PD大鼠有一定治疗作用。

TH基因修饰的神经干细胞移植治疗帕金森病的实验研究

目的 探讨TH基因修饰的神经干细胞脑内移植对帕金森病(PD)的治疗作用。方法构建pN2 ATH逆转录病毒载体质粒,用PA317细胞包装,G418筛选阳性克隆,病毒上清感染神经干细胞,将表达TH的神经干细胞植入PD大鼠纹状体内,测定PD大鼠旋转行为改善,DA和DOPAC含量变化,以及TH在纹状体的表达。结果 TH基因修饰的神经干细胞移植8周时能显著降低PD大鼠旋转行为,增加纹状体DA和DOPAC含量,TH在纹状体内的表达增加,疗效好于单纯神经干细胞移植组。结论TH基因修饰的神经干细胞移植对PD大鼠有明显的治疗作用,可望为PD治疗提供新的途径。

中国人常染色体隐性遗传性多巴反应性肌张力障碍TH基因突变分析

目的 研究中国人常染色体隐性遗传性 (autosomal recessive,AR)多巴反应性肌张力障碍(dopa- responsive dystonia,DRD)患者酪氨酸羟化酶 (tyrosine hydroxylase,TH)基因的突变特点。方法 应用聚合酶链反应 -单链构象多态性技术和 DNA序列分析方法对 5个 AR- DRD家系的先证者和两例散发DRD患者进行 TH基因突变分析。结果 TH基因第 1～ 2、5～ 11、13～ 14外显子的扩增产物未见异常电泳条带 ,DNA直接测序 TH基因的第 3、4、12外显子 ,结果未发现异常。结论 TH 基因在中国人 AR-DRD家系中突变率不高 ,提示我国 AR- DRD患者具有遗传异质性 ,可能存在新的致病基因。

TH基因变异致儿童酪氨酸羟化酶缺乏症的临床与遗传学分析

目的总结儿童酪氨酸羟化酶缺乏症(THD)患者临床与遗传学特征,提高医师对该病的认识。方法回顾性总结分析2011年5月至2020年1月首都医科大学附属北京儿童医院神经内科确诊的33例TH基因变异致THD患儿的临床表现、治疗及基因突变谱资料,并进行随访。结果33例THD患儿中,女19例,男14例;起病年龄0~6.3岁;起病诱因:感染、发热后起病13例,缺氧起病1例,无诱因起病19例。临床表现:轻型多巴反应性肌张力障碍7例,重型婴儿帕金森病伴运动发育迟缓16例,极重型进行性婴儿脑病10例。THD患儿症状呈波动性,晨轻暮重26例,感染加重22例,疲劳加重30例。THD患儿首发症状为尖足行走伴肢体僵硬7例、运动发育落后或倒退伴肢体软弱26例、震颤8例、眼睑下垂2例、肌张力障碍持续状态3例。THD患儿逐渐出现肢体僵硬23例、肢体松软27例、肢体活动减少27例、面部表情减少24例、震颤18例、尖足行走20例、马蹄内翻足7例、眼睑下垂8例、动眼危象10例、流涎21例、吞咽困难12例、构音障碍16例、呼吸困难3例、睡眠增多10例、睡眠减少5例、情绪烦躁15例、情绪淡漠2例、出汗多8例、肌张力障碍持续状态6例。THD患儿右侧肢体受累严重6例,下肢受累严重14例。THD患儿家族史阳性8例。33例THD患儿予左旋多巴治疗后症状均有不同程度缓解,但其中10例出现异动症或烦躁的不良反应。截至2020年1月末次随访时,4例THD患儿失访,余29例年龄为0.8~13.2岁,其中22例临床症状基本消失。33例THD患儿中共发现25种不同TH基因变异,5种热点变异依次为c.698G>A(13例)、c.457C>T(9例)、c.739G>A(6例)、c.1481C>T(4例)、c.694C>T(3例)。共发现13种未见文献报道的新基因变异(c.1160T>C、c.1303T>C、c.887G>A、c.1084G>A、c.1097A>T、c.734G>T、c.907C>G、c.588G>T、c.992T>G、c.755G>A、c.184-6C>T、c.1510C>T、c.910G>A),其中c.910G>A(2例)为可能的中国人群创始人变异。结论TH基因变异致THD多于婴幼儿期起病,临床症状复杂多样,本研究的THD患儿临床症状以重型多见,极重型和轻型次之,重型和极重型易误诊,所有THD患儿使用左旋多巴治疗疗效显著。发现了1个可能的中国人群创始人变异(c.910G>A),c.698G>A和c.457C>T变异主要出现在重型和极重型THD患者中,c.739G>A主要出现在轻型THD患者中。

大鼠骨髓间充质干细胞转染人TH基因的实验研究

目的 评价酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)基因修饰骨髓间充质干细胞(mesenchymalstem cells,MSCs)后TH的表达情况及转染TH基因对MSCs的影响。方法 构建含人TH基因的pCMV/hTH质粒,用脂质体转染原代培养的大鼠MSCs;Western blot及免疫细胞化学染色鉴定TH基因的表达及MSCs的分化情况;MTT比色法测定转染后的MSCs细胞活性,并与未转染的MSCs进行细胞活性比较。结果 构建的pCMV/hTH质粒经ECoRI酶切后产生1.9 kb和5.3 kb的片段,与回收的目的基因及载体基因片段大小相符;转基因后的MSCs Western blot及免疫细胞化学染色显示TH染色阳性;转染后MSCs未见有NeuN,GFAP的表达;MTT比色法测定细胞活性,未转染与转染者差异无显著性。结论 构建的TH基因能在体外培养的鼠MSCs中较好的表达,转染不会诱导MSCs向神经样细胞分化,对MSCs细胞活性无明显影响。

GFP标记的TH基因在帕金森病大鼠脑内的表达

目的:探讨HTH_1基因治疗帕金森病的可能性。方法:以绿色荧光蛋白(GFP)作为标记,观察HTH_1基因在体外和脑内的表达。结果:构建同时表达GFP和HTH_1双基因的多基因表达载体GC-GFP-P-HTH_1-SN,并转染L-6TG细胞,移植入帕金森病模型大鼠纹状体内,用荧光显微镜、流式细胞仪、免疫组化、Western blotting等方法检测GFP、THT_1在体外和脑内均有表达。结论:本实验为外源基因表达产物的检测提供一个新方法。

TH基因相关多巴反应性肌张力不全临床表型和基因变异特点10例分析

目的 总结TH基因相关的多巴反应性肌张力不全(DRD)临床表型及基因变异特点。方法 回顾性收集2014年1月至2021年7月在北京大学第一医院儿科门诊就诊的TH基因相关DRD患儿资料,对其临床表现和基因检测结果进行分析。结果 共收集10例TH基因复合杂合变异相关的DRD患儿资料,含13种不同变异,其中9种变异国际已报道(p. Arg233His、p. Arg169Stop、p. Arg318X、p. Arg202His、p. Arg153*、p. Thr404Met和p.Gly247Ser、p.Gly284Ser、p.Gly216Ser),4种变异是国际上尚未报道的新变异(c.738-2A>G、Exon3-8(del)、p.Thr399Thr和c.580+1G>C)。10例起病年龄为3~10月龄(中位年龄为4月龄)。以发作性双眼斜视起病1例,以姿势异常起病1例,以发作性肢体僵硬起病1例,以运动发育落后起病7例。10例患儿均有运动发育落后,7例有语言发育落后,5例有发作性双眼斜视,3例有发作性肢体僵硬,2例有足尖行走,2例有伸舌困难,2例有流涎,2例有非癫痫性肌阵挛,1例有足外翻,1例有发作性双侧腕关节屈曲。10例均给予口服多巴丝肼治疗,发作性双眼斜视、肢体僵硬、伸舌困难、流涎、非癫痫性肌阵挛及发作性双侧腕关节屈曲症状治疗后消失;7例运动发育恢复正常,3例较前进步;2例语言发育恢复正常,5例较前进步;1例足尖行走姿势消失,1例较前改善;1例足外翻较前改善。结论 TH基因变异相关DRD的临床特点为婴儿期起病,以运动和语言发育落后、发作性双眼斜视和肢体僵硬为主要表现。口服多巴丝肼可明显改善症状,但少数患儿会遗留语言、运动功能障碍及足外翻。

TH基因相关的多巴反应性肌张力障碍诊治进展

多巴反应性肌张力障碍(DRD)是一种临床综合征,其特征为儿童期出现的对低剂量左旋多巴有显著且持续反应的肌张力障碍。多巴胺合成通路中任何一个环节的缺失均能导致该病。TH基因突变引起的DRD呈常染色体隐性遗传,并引起酪氨酸羟化酶(TH)合成减少,从而导致广泛性的多巴胺及儿茶酚胺缺乏。但TH缺乏的DRD(TH-DRD)患者临床表现可不典型,轻症患者以肌张力不全为主要表现,可逐渐发展为痉挛性截瘫,可伴有帕金森样表现,多数对左旋多巴反应良好,重症患者则表现为进行性复杂性婴儿脑病,对左旋多巴反应差,且多遗留智力发育问题。多数患者脑脊液中的高香草酸(HVA)下降。但由于该病临床表现不具有特征性,实验室检查也无特异性,故目前基因检测仍是诊断该病的唯一可靠标准。小剂量左旋多巴对大部分轻症患者疗效肯定,对重症患者也可一定程度上改善症状。

神经干细胞基因转导治疗帕金森病的研究进展

随着神经干细胞研究的逐渐成熟,神经干细胞移植是未来治疗帕金森病的主要发展方向。本文就近年来神经干细胞的来源、基因转导和移植治疗帕金森病等方面的研究进展予以综述。

目的基因选择在帕金森病基因治疗中的研究进展

基因治疗是目前帕金森病治疗研究的热点,主要集中于两类目的基因:一是能增加多巴胺合成的目的基因,如TH、AADC等;二是应用神经营养因子,尤其是GDNF,抑制神经变性,促进神经纤维再生。

TH杂合突变致多巴胺反应性肌张力障碍一例报道并文献复习

多巴胺反应性肌张力障碍(dopa-responsive dystonia, DRD)是一种十分罕见的遗传性肌张力障碍疾病,其患病率为(0.5~1.0)/1 000 000[1]。其临床表现十分复杂,导致临床早期治疗极困难,误诊率较高,致使不少患者被误诊而辍学、肢体残疾,很多病例直至生活不能自理方才明确诊治,部分患者确诊时已遗留明显的后遗症[2]。已判定出DRD疾病的重要致病基因有GCH1基因、TH基因和SPR基因。

地高辛精标记 RNA 探针原位杂交的简便方法

用地高辛精标记ＴＨ基因合成ＲＮＡ探针，在冰冻组织切片上进行原位杂交，通过碱性磷酸酶催化的呈色反应，检测在基因治疗帕金森病大鼠动物模型研究中酪氨酸羟化酶基因在脑内的表达。实验结果表明，简化原位杂交方法可适应于任何实验室。

酪氨酸羟化酶缺乏症导致多巴反应性肌张力不全患儿临床及遗传特点

【目的】探讨酪氨酸羟化酶缺乏症(THD)导致多巴反应性肌张力不全患儿的临床、遗传特点、治疗和预后。【方法】回顾分析2017年6月至2020年11月神经内科住院部收治的6例THD导致多巴反应性肌张力不全患儿的临床资料及基因检测结果。【结果】6例患儿来自4个不同家庭,男4例,女2例,均患有肌张力障碍。中位发病年龄为11.5个月(3个月~4岁),6例患者发现TH基因复合杂合突变。TH基因共检测到7个突变,包括5个已知突变c.698G>A(p.R233H)、c.1145T>C(p.I382T)、c.739G>A(p.G247S)、c.1481C>T(p.T494M)、c.880G>C(p.G294R),以及2个新突变:c.1279A>G(p.Y427H)和c.1128_1138del(p.Q377GfsTer12)。他们服用美多芭治疗,维持剂量为2~15 mg(/kg·d)。所有患者对美多芭反应良好,但病例4遗留有脊柱侧弯。【结论】THD临床表现多样,尽早识别和启动左旋多巴治疗,可明显改善预后。本研究检测到TH基因2个新的突变,错义突变c.1279A>G及移码突变c.1128_1138del。本研究拓宽了THD的基因型谱,为了解THD的分子机制提供了新思路。基因检测是THD最重要的诊断方法,对后续治疗及遗传咨询有指导意义。

酪氨酸羟化酶基因变异致多巴反应性肌张力障碍患儿临床及遗传特点分析

目的:探讨酪氨酸羟化酶(TH)基因变异致多巴反应性肌张力障碍(DRD)患儿的临床和遗传学特征。方法:回顾分析2017年1月至2022年8月郑州大学第三附属医院儿童康复科收治的9例TH基因变异致DRD患儿的一般情况、临床表现、实验室检查、基因检测结果及随访资料。结果:9例TH基因变异致DRD患儿中男3例、女6例,确诊年龄为12.0(8.0,15.0)月龄。8例重型患儿首发症状为运动发育落后或发育倒退,临床表现包括运动发育落后8例,躯干肌张力低下8例,四肢肌张力低下7例,运动减少6例,面部表情少4例,震颤3例,四肢肌张力障碍3例,晨轻暮重2例,上睑下垂2例,四肢肌张力增高1例,多涎1例。1例极重型患儿首发症状为运动发育落后,临床表现包括明显运动发育落后、躯干肌张力低下、频繁动眼危象、肌张力障碍持续状态、运动减少、面部表情少、睡眠明显减少。9例患儿基因检测共发现11个TH基因变异,包括5个错义变异、3个剪切位点变异、2个无义变异、1个插入变异,其中2个变异[c.941C>A(p.T314K)、c.316_317insCGT(p.F106delinsSF)]为尚未见报道的新变异。9例患儿随访40(29,43)个月,无失访。8例重型患儿中1例应用左旋多巴片,7例应用多巴丝肼片治疗,症状均有明显改善;后期随着患儿体重增加,未增加药物剂量,疗效仍稳定,未见明显不良反应。应用多巴丝肼片治疗的1例重型患儿治疗早期出现异动症,加用盐酸苯海索片后症状消失。末次随访时,7例重型患儿运动发育恢复正常,1例重型患儿因治疗时间仅2个月仍存在运动发育落后;1例极重型患儿对多巴丝肼片极度敏感、用药后有明显烦躁的不良反应,治疗无明显效果。结论:TH基因变异致DRD以重型多见,临床表现多样,易误诊,重型患儿对左旋多巴片或多巴丝肼片反应良好,但需较长时间才能确定治疗效果,长期用药虽然患儿体重增加,但无需增加剂量仍疗效稳定,无明显不良反应。