子宫炎性肌纤维母细胞肿瘤通常存在ALK与IGFBP5和THBS1基因的融合

炎性肌纤维母细胞肿瘤能够发生在包括子宫在内的多个解剖部位。子宫炎性肌纤维母细胞肿瘤与发生在软组织的炎性肌纤维母细胞肿瘤相似，也通常表达ALK，并存在ALK基因重排。该文着重分析子宫炎性肌纤维母细胞肿瘤的基因融合特征。

表达禽流感H5N1血凝素抗原(HA)和H9N2血凝素抗原(HA)融合基因重组腺病毒二价苗的构建

为了构建禽流感病毒H5N1亚型禽流感病毒HA和H9N2亚型禽流感HA融合基因表达的重组腺病毒。根据流行病学调查并参考文献研究结果,合成了优势流行H5N1和H9N2的保护性抗原HA基因的融合基因片段,并将该融合基因片段克隆到在pUC57载体,命名为pUC-57H5H9HA。该融合基因片段经特异酶切后与腺病毒穿梭质粒pDC315连接,获得携带目的融合基因腺病毒穿梭质粒pDC315-H5H9HA;将该重组穿梭质粒与AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒(pBHGlox(delta)E1,3Cre)经Cre/loxP酶切重组,构建成重组腺病毒(rAd-H5H9HA);Ad-H5H9HA感染293细胞后,扩增病毒基因,纯化病毒及检测病毒滴度。PCR鉴定及基因测序分析,H5N1HAH9N2HA(H5H9HA)融合基因表达的重组腺病毒载体构建成功;经过重组腺病毒r Ad-H5H9HA免疫SPF鸡后的抗体检测,证实了重组腺病毒r Ad-H5H9HA诱导了H5N1和H9N2的特异抗体,而且抗体水平达到了国家免疫标准。本研究成功构建的重组腺病毒rAd-H5H9HA,可以作为预防H5N1和H9N2两个亚型病毒的二价疫苗使用,为将来禽流感的预防控制提供了一种新的可能。

蛋白激酶全抑制分析揭示KG-1细胞增殖的分子机制

目的:通过分析KG-1细胞对各种蛋白激酶抑制剂的反应,探讨其增殖的分子机制。方法:采用CCK-8法、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western-blot检测各种蛋白激酶抑制剂对KG-1细胞增殖、相关基因mRNA表达水平以及FGFR1下游信号通路蛋白磷酸化水平的影响。结果:NVP-BGJ398和PD173074有效抑制KG-1细胞的增殖,表明FGFR及其下游信号通路在KG-1细胞增殖过程中具有关键作用。使用FGFR抑制剂处理后,p-FGFR1和p-STAT5水平显著下降(P<0.001),p-Akt水平稍有下降(P<0.05),并未影响p-ERK水平(P>0.05)。结论:FGFR1OP2-FGFR1主要作用于下游STAT5信号通路,以促进细胞增殖。蛋白激酶全抑制分析是一种可靠而直接的方法,可用于确定癌细胞增殖的分子机制。

GATA1不同激酶活性突变体质粒的构建及蛋白表达和亚细胞定位

目的采用大引物法构建GATA1不同激酶活性突变体GATA1 S161A S187A(死型)和GATA1 S161D S187D(激活型)真核表达载体,并证实其融合蛋白在细胞内的表达及定位,旨在进一步探讨其生物学功能和潜在肿瘤治疗靶点。方法以GFP-GATA1 WT为模板,采用大引物法扩增S161A S187A、S161D S187D突变体片段,双酶切克隆至p EGFP-C1表达载体中,将重组质粒转染至HEK293中,经免疫印迹鉴定融合蛋白的表达。结果用大引物PCR法成功构建GATA1不同激酶活性突变体的真核表达载体p EGFP-GATA1 S161A S187A和p EGFP-GATA1 S161D S187D,验证了其融合蛋白表达。共聚焦激光显微镜技术显示,融合蛋白主要定位于细胞核内。结论利用大引物法成功构建GATA1不同激酶活性突变体真核表达载体,并为进一步进行该突变体的结构和功能研究奠定了基础。

甲型H5N1禽流行性感冒病毒血凝素抗原和霍乱毒素B亚单位融合蛋白真核表达载体的构建与鉴定

目的构建甲型HSN1禽流行性感冒流感病毒血凝素（HA）抗原和霍乱毒素B亚单位（CTB）融合蛋白真核表达载体，并研究其在COS7细胞中的表达特性，及其在动物体内不同时间点诱导机体产生特异性抗体的情况。方法采用PCR技术分别克隆CTB基因和HA基因，并用BamHI酶切2个基因片段，在T4连接酶的作用下构建CTHA融合基因（CH基因）。双酶切后，将CH基因插入真核表达质粒pCI—neo中，构建甲型H5N1禽流感病毒融合蛋白真核表达载体（pCI—CH）。将pCICH质粒转染COS7细胞，利用Western印迹、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SD孓PAGE）检测HA抗原的表达；间接EI-ISA法检测免疫接种新西兰大白兔后其血清中HA抗原的特异性抗体效价，以及与H1N1、H9N1、H3N2和乙型流感病毒的交叉反应情况。结果pCl—CH真核表达载体（即核酸疫苗）构建成功，可在cos7细胞中高效表达，并能在大白兔体内诱导产生特异性抗pcI-cH抗体。核酸疫苗pC-CH特异性抗血清不仅可以与甲型HSNl流感病毒特异性结合（P／N〉2．1），而且可以与HINl、HgNl和H3N2毒株发生特异性反应；但该抗血清与乙型流感病毒无特异性反应。结论构建的甲型H5N1禽流感病毒核酸疫苗具有良好的免疫原性。

肠炎沙门菌感染对济宁百日鸡盲肠miR-34a-5p及其靶基因表达的影响

肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis,SE)作为一种人畜共患菌,对人类和畜禽健康产生了较大威胁。microRNA在鸡肠炎沙门菌感染中发挥着重要调控作用,前期研究表明,miR-34a-5p参与肠炎沙门菌防御调控过程,但对于肠炎沙门菌感染后miR-34a-5p和其靶基因SVOP、CCL4和THBS1在盲肠中的表达调控还不清楚。本研究选取肠炎沙门菌阴性的2日龄济宁百日鸡,接种肠炎沙门菌,接种后第1d和第3d分别采集试验组和对照组的盲肠组织,并对miR-34a-5p、SVOP、CCL4和THBS1的表达量进行比较分析。研究结果表明,在感染后第1d和第3d,对照组和试验组SVOP、CCL4和THBS1表达差异显著,miR-34a-5p差异不显著(P<0.05),且感染后第1d,试验组miR-34a-5p、SVOP、CCL4表达量高于对照组,THBSI低于对照组;感染后第3d,试验组SVOP、CCL4表达量高于对照组,miR-34a-5p和THBSI表达量试验组低于对照组。研究结果将为microRNA及其靶基因在鸡SE感染中的调控研究奠定基础。

GST-NLS(ING1)融合蛋白表达载体构建及表达纯化的研究

目的构建P33ING1b核定位信号肽(NLS)与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)重组的融合蛋白(GST-NLS)原核表达载体及建立GST-NLS纯化技术。方法先用RT-PCR从ING1基因中扩增编码NLS的cDNA片段,将其插入克隆质粒pbluescript-SK,再以克隆质粒NLS片段为模板,PCR扩增NLScDNA片段,并加入限制性酶切位点和终止子,进而将其插入原核表达质粒pGEX-5X-3,构建GST-NLS原核表达载体pGEX-5X-3-NLS,最后用IPTG诱导其在大肠杆菌(BL21)中表达,用谷胱甘肽-琼脂糖小珠亲和纯化表达的GST-NLS。结果酶切鉴定和测序分析显示,NLScDNA片段被成功插入pbluescript-SK多克隆位点;NLScDNA片段在pGEX-5X-3-NLS中的插入位点、碱基序列及读码框和终止子的次序完全正确,NLScDNA序列位于表达载体的GST序列下游,插入片段全长183bp。经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-β-D-5-thiogalactoside,IPTG)诱导表达和亲和纯化,从负荷pGEX-5X-3-NLS质粒的BL21菌株中获得了31.57ku的GST-NLS。结论成功建立了重组GST-NLS的原核表达载体、表达菌株及诱导表达和纯化的方法学,为进一步研究p33ING1b入核运载机制提供了重要技术手段。

伴t（5；12）（q31；p13），FIP1L1／PDGFRα阴性慢性嗜酸细胞白血病一例并文献复习

目的提高对慢性嗜酸细胞白血病（CEL）的认识水平。方法报告1例伴t（5；12）（q31；p13），FIP1样基因1（FIP1L1）血小板衍化生长因子（PDGFRα）（-）CEL的诊治过程。外周血及胸腔积液细胞的免疫表型采用流式细胞术（FCM）分析，染色体采用G显带分析，FIP1L1／PDGFRα融合基因表达采用RT-PCR技术检测，骨髓、肺及脾组织行常规病理学检查。结果1例16岁女性患者严重贫血、发热、脾大、血小板减少、嗜酸细胞显著增高，持续22个月。骨髓嗜酸细胞浸润伴纤维化改变；肺和脾组织均呈嗜酸细胞浸润，伴脾栓塞。克隆性染色体异常为t（5；12）（q31；p13），不表达FIP1L1／PDGFRα融合基因。外周血及胸腔积液细胞中除大量嗜酸细胞外，CD3^-、CD4^-、CD8^＋异常T淋巴细胞分别占淋巴细胞总数的5．43％和1．66％。患者对羟基脲、泼尼松、干扰素和甲磺酸伊马替尼（400mg／d共40d）治疗无效，小剂量阿糖胞苷、米托蒽醌、长春新碱、环磷酰胺、甲氨蝶呤、泼尼松等联合化疗仅有短期效果。患者最终死于心、肺、肝、肾多脏器功能衰竭。结论本例FIP1L1／PDGFRα（-）CEL符合WHO诊断标准，对多种药物及甲磺酸伊马替尼治疗无效，应在疾病早期尽早争取造血干细胞移植。CD3^-、CD4^-、CD8^＋克隆性T细胞异常与CEL发病的关系值得关注。

肢端纤维软骨黏液样肿瘤1例

患者男,44岁,左手小指皮下结节3年。皮肤科检查:左手小指末节背侧一0.4 cm×0.4 cm皮下结节,触之橡皮样硬度,无压痛,末端指间关节活动不受限。术后组织病理:肿瘤含有丰富的纤维样、软骨样、黏液样间质。肿瘤细胞呈卵圆形至短梭形,核仁不明显,未见有丝分裂。细胞排列杂乱或呈小团簇状。免疫组化:肿瘤细胞表达波形蛋白、CD34、转录因子ERG、SOX9,不表达S100、P63、广谱角蛋白(AE1/AE3)、上皮膜抗原、平滑肌肌动蛋白、结蛋白,Ki67增殖指数小于1%。诊断:肢端纤维软骨黏液样肿瘤。