基于CRISPR/Cas9技术构建IDO1基因敲除的THP-1细胞株及其表型研究

目的 采用CRISPR/Cas9技术构建吲哚胺-2,3-双加氧酶1(IDO1)基因敲除的THP-1细胞株,为研究IDO1在巨噬细胞中的作用提供细胞模型。方法 设计靶向IDO1基因的3条向导RNA(guide RNA,gRNA),分别构建IDO1-gRNA重组质粒,酶切及测序鉴定后,包装成Lenti-IDO1-gRNA慢病毒。利用Cas9慢病毒感染THP-1细胞获得稳定表达Cas9蛋白的细胞株,再经Lenti-IDO1-gRNA慢病毒感染敲除IDO1基因,有限稀释法获得单克隆细胞株。T7E1酶切检测gRNA打靶效率,PCR产物测序和Western blot鉴定IDO1基因敲除效果。CCK8法检测IDO1基因敲除对THP-1细胞增殖活性的影响,流式细胞术检测对巨噬细胞标志物CD11b、CD68和CD14表达的影响,中性红法检测巨噬细胞吞噬功能。结果 成功构建了3种IDO1-gRNA重组质粒,3条gRNA均能有效编辑IDO1基因,以gRNA2编辑效率最高。经PCR产物测序和Western blot验证获得了3株THP-1 IDO1-KO单克隆细胞株,并发现IDO1基因敲除可抑制THP-1细胞增殖,下调THP-1巨噬细胞CD11b、CD68表达,上调CD14表达,增强THP-1巨噬细胞吞噬功能。结论 成功构建IDO1基因敲除的THP-1细胞株;IDO1对THP-1细胞增殖活性、分化调节以及THP-1巨噬细胞吞噬功能调节有重要作用,为后续进一步探讨IDO1基因在巨噬细胞中的功能及机制研究奠定基础。

钙结合蛋白S100A4对BCG感染THP-1细胞自噬的调控作用

本研究旨在探究牛结核分枝杆菌减毒株卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)感染人单核巨噬细胞THP-1后,钙结合蛋白S100A4对细胞自噬的调控作用。以感染复数为10∶1的BCG感染THP-1细胞不同时间,用Western blot检测S100A4和LC3Ⅱ的表达,以确定最佳感染时间,并采用透射电镜观察自噬体数量变化。在BCG单独感染或与S100A4小干扰RNA共处理THP-1细胞12 h后,采用qRT-PCR检测S100A4及自噬相关因子--微管相关蛋白轻链3II (microtubule-associated protein light chain 3Ⅱ, LC3Ⅱ)、自噬相关蛋白7(autophagy-related gene 7, Atg7)、Beclin-1在mRNA水平上的表达,采用Western blot检测S100A4、LC3Ⅱ、Atg7、Beclin-1在蛋白水平的表达。利用mRFP-GFP-LC3检测自噬流,激光共聚焦显微镜观察细胞中mRFP-LC3和mRFP-GFP-LC3点状聚集。结果显示:在BCG感染THP-1细胞不同时间后,S100A4和LC3Ⅱ在蛋白表达水平随感染时间的延长先上升后下降,在12 h时表达最高(P<0.001),且自噬体数量明显增多。在mRNA水平上,与siNC组相比,siNC+BCG感染组S100A4、LC3Ⅱ、Atg7、Beclin-1的mRNA表达水平显著上调(P<0.05),当BCG和siS100A4共处理后,S100A4、LC3Ⅱ、Atg7、Beclin-1在mRNA水平的表达显著(P<0.05)或极显著(P<0.01,P<0.001)下调;在蛋白水平上,与未感染组相比,S100A4、LC3Ⅱ、Atg7、Beclin-1的蛋白表达量显著增多(P<0.05),BCG和siS100A4共处理后,S100A4、LC3Ⅱ、Atg7、Beclin-1的蛋白表达量均极显著减少(P<0.001);与未感染组相比,BCG组自噬体的数量极显著增多(P<0.01),siS100A4+BCG组与siNC+BCG组相比,自噬体的数量显著减少(P<0.05)。S100A4对BCG感染巨噬细胞诱导的自噬具有调控作用,S100A4能够促进BCG诱导的THP-1细胞自噬。

登革2型病毒在RAW264.7细胞和THP-1细胞中复制能力及免疫激活能力的比较

目的:比较登革2型病毒(DENV2)在RAW264.7细胞和THP-1细胞中的复制能力及DENV2对这两种靶细胞的免疫激活作用。方法:将DENV2病毒液与靶细胞(RAW264.7细胞和THP-1细胞)分别孵育6h、12h、24h,孵育结束后收集细胞,Trizol法提取不同时间的细胞总RNA,检测RNA纯度和浓度后逆转录为cDNA,使用qRT-PCR检测样本中病毒目的基因DENV2 E及细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-β、ISG15、CCL2的mRNA相对表达量。结果:DENV2感染RAW264.7细胞和THP-1细胞后,DENV2 E基因的表达量均显著上调(P<0.05),且呈现逐渐增加的趋势。6h、12h时,DENV2 E基因在两个靶细胞中的相对表达量一致;24h时,DENV2 E基因在RAW264.7细胞中的相对表达量显著高于THP-1细胞。与未感染DENV2组相比,DENV2感染RAW264.7细胞和THP-1细胞6h、12h、24h后,IL-1β、IL-6、TNF-α、ISG15、IFN-β、CCL2基因的相对表达量均显著升高(P<0.05),且在RAW264.7细胞中的相对表达量显著高于THP-1细胞。结论:DENV2在RAW264.7细胞中的复制能力强于THP-1细胞的复制能力,且DENV2在RAW264.7细胞中具有更强的免疫激活能力。

猪带绦虫丝氨酸蛋白酶抑制分子Ts-serpin-2对人THP-1细胞炎性细胞因子的表达影响

为了深入研究猪带绦虫丝氨酸蛋白酶抑制分子(Ts-serpin-2)对THP-1细胞炎性细胞因子分泌的调节作用,本实验通过RTPCR从猪带绦虫成虫扩增获得Ts-serpin-2(TsM_000807300)的编码序列CDS,利用毕赤酵母表达Ts-serpin-2重组蛋白。利用发色底物特异性反应检测Ts-serpin-2蛋白对猪胰蛋白酶、胰弹性蛋白酶、牛α-糜蛋白酶、猪胃蛋白酶、木瓜酶、凝血酶和组织蛋白酶G的抑制效果。重组蛋白Ts-serpin-2处理THP-1细胞24 h,应用qRT-PCR和ELISA方法检测各炎性细胞因子差异表达水平。结果显示,真核酵母表达的重组蛋白Ts-serpin-2分子量约为48 kDa,具有蛋白酶抑制活性,对牛α-糜蛋白酶、猪胰弹性蛋白酶及猪胰蛋白酶的活性均有明显的抑制作用。重组蛋白Ts-serpin-2可抑制LPS活化的THP-1细胞促炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12α、IFN-γ和iNOS2 mRNA的转录水平,促进IL-4刺激的THP-1细胞抗炎性细胞因子IL-10的表达。ELISA结果显示,Ts-serpin-2能够抑制巨噬细胞分泌致炎因子TNF-α、IL-6和IFN-γ,刺激IL-10的分泌,与qRT-PCR检测结果基本一致。上述研究结果表明猪带绦虫Ts-serpin-2可通过调节宿主巨噬细胞分泌的炎性因子影响虫体入侵过程中宿主的免疫应答。

IGHG1对人急性髓系白血病THP-1细胞增殖、凋亡的影响

目的:探讨免疫球蛋白G1重链恒定区(IGHG1)对急性髓系白血病(AML)细胞系THP-1细胞增殖、凋亡的影响及其可能的作用机制。方法:体外培养人AML THP-1细胞,分为对照(正常培养的THP-1细胞)、pcDNA3.1[转染IGHG1过表达(pcDNA3.1-IGHG1)阴性对照质粒的THP-1细胞]、pcDNA3.1-IGHG1(转染pcDNA3.1-IGHG1的THP-1细胞)、LY364947[转化生长因子-β(TGF-β)/信号转导蛋白(Smad)抑制剂LY36494720μmol/L处理THP-1细胞)]、si-NC[转染IGHG1小干扰RNA(IGHG1-siRNA)阴性对照的THP-1细胞]、si-IGHG1(转染IGHG1-siRNA的THP-1细胞)和si-IGHG1+LY364947(IGHG1-siRNA和LY364947共同处理THP-1细胞)共7组。荧光定量PCR法检测各组THP-1细胞中IGHG1和免疫球蛋白G(IgG)mRNA的表达;CCK-8法检测各组THP-1细胞增殖活力;流式细胞术检测各组THP-1细胞凋亡率和细胞周期变化;蛋白印迹法检测各组THP-1细胞增殖、凋亡及TGF-β/Smad信号通路相关蛋白的表达。结果:与对照组相比,过表达IGHG1后THP-1细胞中IGHG1和IgG mRNA表达、细胞增殖活力、S期的细胞比例、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、IgG、TGF-β1、磷酸化Smad3(p-Smad3)/Smad3蛋白表达均显著升高(P<0.05),细胞凋亡率、G_(0)/G_(1)期的细胞比例、p21、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白表达均显著降低(P<0.05)。抑制TGF-β/Smad信号通路或沉默IGHG1后THP-1细胞中IGHG1和IgG mRNA表达、细胞增殖活力、S期的细胞比例、Cyclin D1、Bcl-2、IgG、TGF-β1、p-Smad3/Smad3蛋白表达均显著降低(P<0.05),细胞凋亡率、G_(0)/G_(1)期的细胞比例、p21、Bax、Caspase-3蛋白表达均显著升高(P<0.05);且与沉默IGHG1相比,IGHG1基因沉默和TGF-β/Smad通路抑制共同处理的THP-1细胞中IGHG1和IgG mRNA表达、细胞增殖活力、S期的细胞比例、Cyclin D1、Bcl-2、IgG、TGF-β1、p-Smad3/Smad3蛋白表达均显著降低(P<0.05),细胞凋亡率、G_(0)/G_(1)期的细胞比例、p21、Bax、Caspase-3蛋白表达均显著升高(P<0.05)。结论:沉默IGHG1基因可下调IgG的表达,抑制人AML THP-1细胞增殖,阻滞细胞周期进程,并诱导细胞凋亡;其作用机制可能与抑制TGF-β/Smad通路的激活有关。

静注人免疫球蛋白中IgG二聚体含量对IgG Fc段与THP-1细胞表面受体结合能力的影响

目的研究静注人免疫球蛋白(Intravenous immunoglobulin,IVIG)中免疫球蛋白G(Immunoglobulin G,IgG)二聚体含量对IgG Fc段与THP-1细胞表面受体结合能力的影响。方法利用蛋白纯化技术和高效液相色谱(HPLC)技术,制备不同浓度的IgG二聚体,然后采用直接添加的方式,制备得到含有不同浓度IgG二聚体的IVIG。最后利用本实验室已建立的IgG Fc段与THP-1细胞表面Fc段受体结合能力的检测方法,考察IgG二聚体含量对IgG Fc段与细胞表面受体结合能力的影响。结果当IVIG中IgG二聚体含量为1.11%~10.30%时,其与THP-1细胞表面Fc段受体的结合能力为97.67%~135.33%,且这种结合能力与IgG二聚体的含量呈正相关。当IgG二聚体含量超过13.22%时,IgG Fc段与THP-1细胞表面受体的结合能力与IgG二聚体含量则没有相关性。结论一定浓度的IgG二聚体对IVIG中IgG Fc段与THP-1细胞表面受体的结合能力具有促进作用,但尚需动物实验和临床数据进一步验证。

基于CRISPR/Cas9系统建立GPR108缺失的THP-1细胞株及其功能初步研究

目的建立稳定敲除G蛋白偶联受体108(GPR108)基因的人单核细胞白血病细胞系(THP-1),并初步研究其功能。方法根据人GPR108基因序列设计,合成可应用于成簇有规律的间隔短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)的单链引导RNA(sgRNA1和sgRNA2)对应的DNA,利用分子克隆技术在pL-CRISPR.EFS.GFP慢病毒载体中插入sgRNA1和sgRNA2序列,构建重组载体(pL-CRISPR.EFS.GFP-sgRNA1和pL-CRISPR.EFS.GFP-sgRNA2)。将测序正确的重组体与包装质粒(pMD2.G和psPAX2)共转染293T细胞进行病毒包装,收集病毒液并感染THP-1细胞。利用流式细胞分选技术分离GFP+细胞于96孔培养板中,培养获得单细胞克隆。利用聚合酶链式反应(PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测THP-1细胞中GPR108是否敲除成功。应用脂多糖(LPS)刺激GPR108-/-和GPR108+/+的THP-1细胞,Western blot法检测细胞内白细胞介素-8(IL-8)的表达,流式微球技术(CBA)检测细胞培养上清液中的IL-8浓度。结果成功构建重组慢病毒载体pL-CRISPR.EFS.GFP-sgRNA,转染THP-1细胞后通过流式细胞仪分选获得单细胞克隆F9。PCR和Western blot法均证实F9是GPR108-/-THP-1单细胞克隆。LPS刺激GPR108-/-和GPR108+/+THP-1细胞,Western blot和CBA的结果均显示敲除GPR108的THP-1细胞中IL-8的合成和分泌明显减少。结论成功建立GPR108缺失的THP-1细胞株;缺失GPR108的THP-1细胞在受到LPS刺激时产生的趋化因子IL-8显著降低。为后续研究GPR108在免疫炎症中的作用奠定了基础。

淫羊藿苷及其肠菌代谢产物对THP-1细胞分泌细胞因子的影响

目的 :比较淫羊藿苷及其肠菌代谢产物对人组织细胞瘤THP 1细胞分泌 4种细胞因子的影响。方法 :放射免疫测定方法 (RIA)。结果 :在LPS和PMA存在下 ,淫羊藿苷及其肠菌代谢产物 (宝藿苷I和淫羊藿苷元 )对IL 6的产生有促进作用 ,代谢物的作用更强 ,对IL 8的产生有一定的抑制作用。当LPS和PMA不存在时 ,对IL 6的产生无明显影响 ,而对IL 8的产生则有促进作用。不论LPS和PMA存在与否 ,原苷对TNFα的产生有抑制作用 ,原苷及其肠菌代谢产物对IL 1α的产生均有明显抑制作用。结论 :在不同的实验条件下 ,淫羊藿苷及其肠菌代谢产物对各种炎症性细胞因子的产生均有特异的调节作用。

肉苁蓉多糖对THP-1细胞吞噬作用的影响及其机理研究

将单核细胞株THP-1按照随机数字表随机分为观察组和对照组两组,正常的观察组给予肉苁蓉多糖培养液,根据肉苁蓉多糖浓度不同又分为10、50、100μg/L组,对照组不添加肉苁蓉多糖培养液,实验组中的不同浓度组、对照组,每组各24例.比较各组THP-1细胞吞噬率、吞噬指数以及细胞因子分泌水平,以此研究肉苁蓉多糖对THP-1细胞吞噬作用的影响并探讨其发生机理.结果显示,观察组中10、50、100μg/L组单核巨噬细胞吞噬率分别为(17.42±3.19)%、(23.32±3.82)%、(29.41±4.11)%,均高于对照组的(9.34±1.26)%,比较差异有统计学意义(F=162.63,P<0.01);10、50、100μg/L组单核巨噬细胞吞噬指数分别为(0.45±0.13)、(0.67±0.19)、(0.82±0.21),均高于对照组的(0.22±0.09),比较差异有统计学意义(F=62.60,P<0.01);10、50、100μg/L组IFN-γ分别为(4.21±1.11)、(7.38±1.86)、(9.51±2.10)mg/L,均高于对照组(0.79±0.06)mg/L,比较差异有统计学意义(F=152.74,P<0.01);10、50、100μg/L组IL-1分别为(24.11±4.15)、(74.60±11.21)、(103.61±19.65)mg/L,均高于对照组(10.21±1.39)mg/L,比较差异有统计学意义(F=343.15,P<0.01),各指标进一步采用Newman-Keals法进行两两比较均有统计学意义(P<0.01).由此认为,肉苁蓉多糖可能通过增强THP-1细胞吞噬能力和促细胞因子释放发挥免疫调节功能.

基于THP-1细胞模型荆芥挥发油抗炎作用的NLRP3炎症小体调控机制研究

目的:以THP-1细胞为载体,观察荆芥挥发油抗炎作用及与NLRP3炎症小体激活相关的调控作用机制。方法:MTS法测定荆芥挥发油对THP-1细胞的毒性作用;利用佛波酯(PMA)将THP-1细胞诱导分化为巨噬细胞,然后采用LPS与激活物(ATP、Nigericin、CPPD或Ca Cl2)进行造模,观察荆芥挥发油对NLRP3炎症小体激活的影响,ELISA法检测细胞上清中IL-1β、IL-18水平;RT-PCR法检测细胞中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-1α、IL-6 mRNA的表达。结果:荆芥挥发油浓度≤0.4 mg/mL时对THP-1巨噬细胞无毒;0.2 mg/mL荆芥挥发油对4种激活物诱导的THP-1巨噬细胞上清中IL-1β的高分泌具有显著抑制作用(P<0.05或P<0.01),且对ATP或Nigericin诱导下THP-1巨噬细胞NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-1α、IL-6 mRNA的高表达具有显著下调作用(P<0.05或P<0.01)。结论:荆芥挥发油体外能抑制ATP、Nigericin、CPPD或Ca Cl2诱导的THP-1巨噬细胞IL-1β高分泌,抑制ATP或Nigericin诱导下THP-1巨噬细胞裂解液中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-1α、IL-6 mRNA的高表达,其抗炎作用的发挥与干预NLRP3炎症小体的激活有关。

人参皂苷Ro促进THP-1细胞向DC分化的作用

目的:探讨人参皂苷Ro联合细胞因子(GM-CSF与IL-4)促进人单核白血病细胞(THP-1)向树突状细胞(DC)分化的作用。方法:筛选细胞因子诱导白血病源DC敏感细胞株;采用细胞因子联合人参皂苷Ro诱导筛选的敏感细胞株THP-1向DC分化。培养体系中分别加入小(5μmol/L)、中(10μmol/L)、大(20μmol/L)剂量人参皂苷Ro,流式细胞术检测白血病来源DC表面标志CD1a、MHCⅡ、共刺激分子CD86表达;逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测白血病来源DC MHCⅡ、CD86 mRNA转录水平;酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养上清TNF-α、IL-6蛋白水平。结果:THP-1是细胞因子诱导DC分化的敏感白血病细胞株,与单纯细胞因子诱导比较,细胞因子联合人参皂苷Ro作用后,白血病来源DC表面标志CD1a、MHCⅡ、共刺激分子CD86比例显著升高(P<0.05),CD1a、CD86及MHCⅡ转录水平显著升高(P<0.05),培养上清TNF-α、IL-6蛋白水平显著升高(P<0.05)。结论:人参皂苷Ro能明显促进细胞因子诱导THP-1细胞向DC分化。

绣球菌多糖诱导K562、THP-1细胞凋亡的研究

旨在研究绣球菌多糖对K562、THP-1细胞凋亡的诱导作用。利用MTT比色法测定绣球菌多糖对K562、THP-1细胞增殖的抑制作用;通过吖啶橙染色观察K562、THP-1细胞形态学上的改变;同时利用DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡的情况。结果表明:经绣球菌多糖处理后,K562、THP-1细胞的生长受到了显著抑制,最大抑制率分别为46.57%和59.82%;K562、THP-1细胞出现了细胞凋亡的形态学典型特征;同时,琼脂糖凝胶电泳呈现DNA梯形条带。由此说明,绣球菌多糖可在体外抑制K562、THP-1细胞生长并诱导其凋亡。

熊果酸减轻LPS诱导的THP-1细胞损伤

目的探讨熊果酸减轻脂多糖诱导的THP-1细胞损伤的作用及其机制。方法以脂多糖诱导的THP-1炎性细胞为模型,MTT法检测不同浓度的熊果酸(0.1、1、5、10、20、40和80μmol/L)对细胞增殖的影响,RT-PCR法检测TLR4、MCP-1和IL-6 mRNA的表达,ELISA法检测MCP-1和IL-6表达,Western blot法检测P65、磷酸化P65蛋白表达,荧光素酶报告系统检测核转录因子κB(NF-κB)活性。结果与对照组比较,LPS作用组能显著增高MCP-1、TLR4、IL-6 mRNA和MCP-1、IL-6、P65、磷酸化P65蛋白的表达并上调NF-κB活性(P<0.05);与LPS单独作用组比较,熊果酸(1和5μmol/L)干预组能够显著降低MCP-1、TLR4、IL-6mRNA和MCP-1、IL-6表达水平并下调NF-κB活性(P<0.05)。结论熊果酸可能是通过下调NF-κB活化减轻脂多糖诱导的THP-1细胞的损伤。

NF-κBp50参与IL-4在THP-1细胞中诱导DC-SIGN的表达(英文)

树突状细胞表面特异的胞间黏附分子3捕获非整合素(DC-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing nonintegrin,DC-SIGN)是树突状细胞表面特异的蛋白,在抗原呈递过程中起关键作用.这种特异性的表达和DC-SIGN的调节机制有关.到目前为止,DC-SIGN表达调控的机制还不是很清楚.IL-4是诱导DC-SIGN表达的最重要的细胞因子之一,而NF-κB是调控细胞信号转导的一个重要调控因子,两者都和DC-SIGN的表达调节相关.研究了IL-4和NF-κB对DC-SIGN启动子活性、对DC-SIGN表达的影响以及IL-4和NF-κB之间相互作用的关系.发现:DC-SIGN启动子中NF-κB位点缺失可以使DC-SIGN启动子活性下降大约50%,NF-κBp50可以促进DC-SIGN在THP-1细胞的表达,IL-在THP-1细胞诱导DC-SIGN表达的同时,也促进了NF-κBp50的表达.这些结果显示,在THP-1细胞中NF-κBp50参与IL-4诱导的DC-SIGN表达.

感染布氏杆菌后的THP-1细胞的蛋白质组学研究

在布氏杆菌(Brucella)的感染免疫过程中,单核巨噬细胞的应答起着非常关键的作用,而毒力不同的布氏杆菌引起的宿主反应截然不同。用双向电泳技术对THP-1单核细胞受毒力不同的布氏杆菌株侵袭后的全细胞蛋白谱进行差异比较和分析,共发现了38个差异表达的蛋白质点。这些点经过胶内酶切后进行MALDI-TOF质谱鉴定,每个蛋白质点的肽质量指纹图谱都在人类的蛋白质组数据库中用Mascot进行检索后,发现这些差异表达的蛋白主要集中在结构蛋白,信号传导途径和物质代谢等领域,还有一些功能未知的蛋白。这一结果为研究布氏杆菌的感染与致病机制提供了方向,对深入探讨病原菌-宿主的相互作用模式具有参考价值。

水合淫羊藿素对THP-1细胞增殖和凋亡的影响及机制研究

目的:探讨水合淫羊藿素(icaritin)对THP-1细胞增殖和凋亡的影响及其可能的作用机制。方法:用MTS法、流式细胞术和Hoechst 33258荧光染色检测icaritin对TP-1细胞的增殖抑制及促凋亡作用,Western blot技术检测BCL-2、BAX和Caspase-3蛋白的表达。结果:4-32μmol/L icaritin作用24-72 h对THP-1细胞有增殖抑制作用(P<0.05),且呈时间-剂量依赖关系(r=0.946);4-32μmol/L icaritin作用24和48 h,对THP-1细胞有凋亡诱导作用(P<0.05),也显示时间-剂量依赖关系(r=0.924)。icaritin作用THP-1细胞48 h后,THP-1细胞BCL-2蛋白的表达较对照组显著降低(P<0.05),而BAX和Caspase-3表达较对照组显著增高(P<0.05)。结论:Icari血对THP-1细胞有增殖抑制及促凋亡作用,icaritin可能通过线粒体途径诱导THP-1细胞的凋亡。

瘦素对THP-1细胞泡沫化过程中ACAT-1表达的影响

目的 :研究单核或巨噬细胞转分化和泡沫细胞形成过程中瘦素对人酰基辅酶A :胆固醇酰基转移酶(ACAT_1)表达的影响。方法 :在体外模拟动脉粥样硬化 (AS)形成过程中 ,运用放射性同位素标记底物法、逆转录聚合酶链反应、蛋白质免疫印迹法检测ACAT_1mRNA和蛋白表达水平。结果 :单核或巨噬细胞转分化过程中ACAT_1酶活性、蛋白及mRNA水平均升高。巨噬细胞转变为泡沫细胞过程中ACAT_1表达水平无明显变化。高瘦素血症可明显增强单核或巨噬细胞转分化和泡沫细胞形成过程中ACAT_1表达。结论 :高瘦素血症可能通过增强ACAT_1表达导致动脉粥样硬化提前发生。

抗β_2GPI/β_2GPI复合物激活THP-1细胞表达炎性相关因子

目的探讨抗β2糖蛋白I(抗β2GPI)自身抗体与β2糖蛋白I(β2GPI)复合物刺激单核细胞株THP-1表达炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α及可能机制。方法用荧光定量PCR法检测抗β2GPI/β2GPI复合物刺激THP-1细胞不同时间(0.5、1、1.5、2、6 h)后IL-6、IL-8、TNF-αmRNA表达,用免疫荧光染色法及western blot观察THP-1细胞表达IL-6、IL-8、TNF-α蛋白的情况。荧光定量PCR及western blot观察Toll样受体4(TLR4)途径抑制物(TAK-242)干预抗β2GPI/β2GPI复合物对THP-1细胞的刺激作用。结果抗β2GPI/β2GPI复合物(100μg/mL)刺激THP-1细胞不同时间,可使细胞表达IL-6、IL-8及TNF-αmRNA水平逐渐上升,于刺激2 h时IL-6、IL-8及TNF-α达到峰值(P<0.01),免疫荧光染色及western blot证实细胞表达IL-6、IL-8及TNF-α蛋白水平也明显增加。TAK-242(5μmol/L)可显著抑制抗β2GPI/β2GPI复合物诱导的细胞IL-6、IL-8及TNF-α表达。结论抗β2GPI/β2GPI复合物通过TLR4途径,激活THP-1细胞表达炎性细胞因子IL-6、IL-8及TNF-α,参与抗磷脂综合征的病理机制。

大蒜素诱导THP-1细胞凋亡的作用及机制

目的:探讨大蒜素对急性单核细胞白血病细胞株THP-1凋亡及凋亡基因Fas/FasL表达的影响。方法:采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定大蒜素对THP-1细胞增殖抑制率;AO/EB染色观察细胞凋亡形态;Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术(FCM)检测凋亡率的变化;FCM检测细胞凋亡率和细胞周期分布;免疫细胞化学法和Western blot观察细胞Fas、FasL蛋白表达。结果:MTT显示大蒜素能抑制THP-1细胞增殖,呈时间-剂量依赖性,72h中效浓度(IC50)为12.8mg/L。Annexin V-FITC/PI检测凋亡率随大蒜素浓度增加而增加。6.4、12.8mg/L大蒜素作用THP-1细胞72h后,FCM检测G0/G1期细胞比率明显上升,而S期比率明显下降,均出现凋亡峰,凋亡率分别为(22.93±2.93)%和(36.73±2.88)%,呈剂量依赖性,与对照组比较有显著差异(P<0.01)。在荧光显微镜下可区分早、晚期凋亡细胞、活细胞和坏死细胞。免疫组化显示大蒜素作用后Fas/FasL蛋白上调,主要分布在细胞浆和细胞膜。Western blot结果显示Fas/FasL蛋白表达量随大蒜素浓度的升高而增加,呈剂量依赖性。0、6.4、12.8mg/L大蒜素分别作用后Fas蛋白表达水平(相对灰度值)分别为0.2874±0.009,0.427±0.008和0.597±0.011;FasL蛋白表达水平分别为0.212±0.014,0.299±0.028和0.409±0.027;差别均有显著性意义(P<0.01)。结论:大蒜素可诱导THP-1细胞发生凋亡,诱导凋亡的机制可能部分与其上调Fas及FasL表达有关。

PMA对THP-1细胞和RA患者单核细胞及培养上清中CD147表达的影响

目的研究豆蔻佛波醇乙酯(PMA)刺激前后,体外培养的人单核细胞系THP-1细胞和类风湿关节炎(RA)患者外周血单核细胞(humanperipheralbloodmonocytes,HPBM)上及培养上清中CD147的表达。方法以贴壁法分离RA患者HPBM。用PMA刺激体外培养的RA患者HPBM和THP-1细胞,采用流式细胞术动态检测THP-1细胞、RA患者HPBM膜表面CD147的表达。用双抗体夹心ELISA法检测培养上清中CD147分子的含量。结果PMA刺激前,THP-1细胞膜及RA患者HPBM表面CD147分子的表达均较高,培养上清中均可检测到CD147分子。PMA刺激后,THP-1细胞培养上清中CD147的含量升高,THP-1细胞上CD147的表达先升高后降低,最后进入稳定期;RA患者的HPBM上CD147的表达下降,培养上清中CD147的含量升高,于刺激后2d进入稳定期。结论THP-1细胞、RA患者HPBM膜表面CD147分子可从细胞上脱落或由细胞直接分泌到培养液中。PMA可上调可溶性CD147的表达。