黄瓜基于扩增子测序的TILLING技术体系的建立

定向诱导基因组局部突变(TILLING)技术能够对突变群体中的点突变进行快速筛选,而样品混池深度是影响其效率的主要因素。为提高TILLING的突变检测效率,本研究以甲基磺酸乙酯(EMS)诱变群体构建的突变体库为基础,对其中部分M2代植株进行突变性状观察,结果表明表型突变率为10.80%。同时利用已知矮化突变体与野生型进行混池,分别构建96、192、288、384四个不同深度的测序池,使用GATK软件进行突变检测,为对假阳性位点进行有效过滤,候选突变位点分别根据突变类型及归一化深度作为阈值两次进行过滤。结果表明,96~288倍的混池深度均能稳定检出预设的已知突变位点,并与Sanger测序结果相一致。与前人相比,本研究通过优化混池深度与过滤阈值,实现了更高混池深度的突变检测,并在黄瓜中建立了基于扩增子测序的TILLING技术体系,可实现更高通量地对大规模突变群体进行目标突变的鉴定。

TILLING技术的形成和发展及其在麦类作物中的应用

TILLING(Targeting induced local lesions in genomes,定向诱导基因组局部突变技术)是一种高通量的等位变异创制和突变体快速鉴定技术,其实质是将传统的化学诱变方法和突变的高效筛选有效结合的反向遗传学研究方法。其技术原理是将传统的酶切技术与PCR技术相结合后采用红外双色荧光系统进行结果鉴定,从而筛选出相应的突变体。传统的TILLING技术主要用于筛选由人工诱导产生的突变体。Ecotilling技术由TILL-ING技术延伸而来,主要用于鉴定自然界中已经存在的突变体,其与传统的TILLING技术的区别主要为构建DNA池时略有差异。随着该项技术在拟南芥等模式植物中的成功应用,越来越多的人开始将其用于基因组较大的植物之中。本文对近年来TILLING技术在麦类作物中的应用进行了分析,并通过比较不同植物突变体库中的突变频率发现,经EMS处理的小麦等麦类作物突变体库中的突变频率显著高于其他植物,因此相信,TILLING技术将会作为一种常规手段在麦类作物尤其是普通小麦改良中得到越来越广泛的应用。

Ecotilling,一种检测基因多样性的新方法

定向诱导基因组局部突变(TILLING:TargetingInducedLocalLesionsInGenomes)检测技术是将随机化学诱变与PCR方法结合,对目的基因区域进行鉴定筛选的一种低投入、高通量的反向遗传学方法。“Ecotilling”是利用该技术检测自然群体中存在的基因多样性的新方法。目前,TILLING及Ecotilling已被应用于多个物种的基因多样性的研究。本文系统介绍了TILLING及Ecotilling的定义、技术流程与特点、应用概况、常用工具,并展望了该技术的应用前景。

TILLING技术的原理、特点及其在点突变筛选中的应用

TILLING(TargetingInducedLocalLesionsINGenomes),是一种全新的反向遗传学研究方法,它提供了一种高通量、低成本规模化高效筛选化学诱变剂EMS诱发产生点突变的技术。本文简要介绍了TILLING的原理和技术优势,并对其在植物功能基因组学、突变分子育种和预测突变频率中的应用作了初步探讨。

TILLING技术的原理与方法述评

TILLING,即Targeting Induced Local Lesions IN Genomes(定向诱导基因组局部突变技术),是由美国Fred Hutchinson癌症研究中心Steven Henikoff领导的研究小组发展起来的,是一种全新的反向遗传学研究方法。TILLING技术借助高通量的检测手段,快速有效地从由化学诱变剂(EMS)诱变过的突变群体中鉴定出点突变。目前,TILLING已被应用于多种生物的研究中。本文系统介绍了TILLING技术的基本原理、技术路线及其技术优势,同时列举了TILLING的应用实例,并展望了TILLING技术的应用前景。

Bowen Ratio Energy Balance Measurement of Carbon Dioxide (CO₂) Fluxes of No-Till and Conventional Tillage Agriculture in Lesotho

Global food demand requires that soils be used intensively for agriculture, but how these soils are managed greatly impacts soil fluxes of carbon dioxide (CO2). Soil management practices can cause carbon to be either sequestered or emitted, with corresponding uncertain influence on atmospheric CO2 concentrations. The situation is further complicated by the lack of CO2 flux measurements for African subsistence farms. For widespread application in remote areas, a simple experimental methodology is desired. As a first step, the present study investigated the use of Bowen Ratio Energy Balance (BREB) instrumentation to measure the energy balance and CO2 fluxes of two contrasting crop management systems, till and no-till, in the lowlands within the mountains of Lesotho. Two BREB micrometeorological systems were established on 100-m by 100-m sites, both planted with maize (Zea mays) but under either conventional (plow, disk-disk) or no-till soil mangement systems. The results demonstrate that with careful maintenance of the instruments by appropriately trained local personnel, the BREB approach offers substantial benefits in measuring real time changes in agroecosystem CO2 flux. The periods where the two treatments could be compared indicated greater CO2 sequestration over the no-till treatments during both the growing and non-growing seasons.

TILLING技术的发展及其在不同植物中的应用

TILLING技术(Targeting Induced Local Lesions IN Genomes)经过十多年的快速发展,已经应用到多种植物点突变高通量筛选与基因功能研究中,检测方法也逐渐趋于多样化,直接测序、毛细管电泳、高分辨熔解曲线等检测方法均得到了较多的应用。与此同时EcoTILLING、DeTILLING及iTILLING等相关技术的发展扩大了TILLING技术的应用范围。本文着重介绍了目前TILLING分析中用到的不同检测方法及相关生物信息学工具,详细评述了TILLING技术在模式植物、主要粮食作物、油料作物、蔬菜等其它作物中的应用与研究进展。

TILLING技术在作物突变研究中的应用现状与前景

定向诱导基因组局部突变(targeting induced local lesions in genomes,TILLING)技术将化学诱变与高通量突变检测技术相结合,可高效、快速地从突变群体中鉴定出目标基因突变位点。本文在概述TILLING技术应用于水稻、小麦、玉米、大豆等作物突变研究现状的基础上,重点综述了TILLING分析群体构建与突变位点检测方法的技术改进与发展,探讨了TILLING技术目前存在的问题与前景。

小麦TILLING分析中CELⅠ酶切及PCR反应体系的优化

在小麦中建立稳定的基于CELⅠ酶切的目的基因突变位点检测技术,有助于高通量鉴定目的基因片段的点突变及提高突变检测效率。本研究以冬小麦品种新麦18空间诱变SP2群体为材料,以小麦糯质基因Waxy为目标片段,通过优化基因组DNA提取方法、调整PCR反应体系中dNTP、Mg2+及引物浓度、改变目标片段CELⅠ酶切缓冲液成分,以及调整纯化过程中的空气相对湿度等方式,优化了小麦TILLING技术体系。在利用PVP-40法提取DNA过程中,研磨器振动频率提高到30/s,KAc溶液的反应时间延伸为20min时,基因组DNA质量和纯度最佳;在设定的浓度范围内dNTP和Mg2+浓度对产物影响差异不明显,均能高效扩增出目的条带。引物浓度对产物影响差异显著,最佳引物浓度为0.4μmol/L。20μl酶切体系中,最佳CEL I酶浓度为0.1U且利用超纯水代替CELⅠ缓冲液。最终在小麦中建立起了基于CELⅠ酶切的高通量TILLING筛选技术体系。

TILLING技术在植物功能基因组及育种中的应用(英文)

随着拟南芥、水稻等模式植物基因组测序计划的全面完成,数据库中大量的DNA序列需要进行功能注释,而用传统的正向遗传学进行基因克隆和近年来发展的反向遗传学(如插入突变、反义RNA、RNAi等技术)方法已不能适应基因组学的发展需求,因此,研发大规模、高通量的基因功能分析方法成为当务之急。TILLING技术(Targetinginducedlocallesionsingenomes)就是在基因组生物学大背景下出现的一种全新的反向遗传学技术。TILLING技术的基本步骤是通过化学诱变方法产生一系列点突变,经过PCR扩增放大和变性复性过程产生异源双链DNA分子,再通过特异性酶切和双色电泳分析识别异源双链中错配碱基,从而检测出突变发生的准确位置。由于具有高通量、大规模、高灵敏度和自动化等特点,能够适应植物功能基因组学研究的要求,TILLING技术已经和即将在功能基因组领域发挥越来越重要的作用。TILLING技术应用于已测序完成的拟南芥和水稻中的突变位点检测并取得了巨大成功;TILLING技术应用于农作物的品种改良,可以帮助实现快速、定向改良作物的品种,同时由于TILLING采用的化学诱变技术与传统诱变育种并无二致,因此在作物改良中采用TILLING技术不存在外源基因转入引发的转基因作物(GMO)争论;由TILLING技术发展来的EcoTILLING技术,具有通量高、成本低、定位准确等优点,可以很好地进行多态性检测和研究基因的功能,已成为开展物种DNA多态性检测和不同物种演替进化研究的有力工具。本文简要介绍了TILLING的原理及操作步骤,讨论了TILLING技术的特点和优点及TILLING技术的应用前景。

TILLING技术研究进展及其在植物空间诱变上的应用前景

在回顾TILLING/ecoTILLING技术的发展及其应用的基础上,阐述了其在植物空间诱变研究领域的应用前景。

TILLING技术及其应用

定向诱导基因组局部突变(targetinginducedlocallesionsingenomes,TILLING)可快速、有效地鉴定和定向筛选突变,是一种全新的反向遗传学技术。现对TILLING的技术流程、核心与特点,及其在突变研究、反向遗传学及功能基因组学、SNP检测、资源创新与分析以及作物遗传改良等方面的应用进行了综述。

TILLING技术及其在植物遗传与改良中的应用

定向诱导基因组局部突变(targetinginduced local lesions in genomes,TILLING)可快速、有效地鉴定和定向筛选突变,是一种全新的反向遗传学技术。介绍了TILLING的技术流程与核心,并对其在突变研究、反向遗传学及功能基因组学、SNP检测、资源创新与分析以及作物遗传改良等方面的应用进行了综述。

TILLING技术在功能基因组学中的应用

TILLING(定向诱导基因组局部突变)技术是近年发展起来的一种高通量筛选化学诱变的点突变的技术,它利用专一识别点突变的核酸酶结合PCR来检测单核苷酸多态性(SNP)。TILLING技术起源于植物基因组研究,逐渐扩展到动物及人类功能基因组学的研究中。无论是筛选突变体还是研究特定基因的重要性,TILLING都具有高通量、自动化的优势。随着此项技术应用范围的扩展,从诱变剂和内切酶的选择到具体的操作方式,以及结果的识别和统计方法,都有了不少改进。在其他相关学科不断发展的大环境下,TILLING技术也在不断发展,其在功能基因组学研究中的作用也会更显著。

TILLING技术应用于家蚕化学诱导突变检测的体系优化

TILLING(Targeting Induced Local Lesions In Genomes)即定向诱导基因组局部突变技术,是近年发展起来的一种高通量检测点突变的反向遗传学方法。本研究从PCR模板量及酶切体系中CELI的酶量两个方面对家蚕TILLING技术的检测体系进行了优化。结果表明:本实验在应用TILLING技术筛选家蚕突变体过程中,用于PCR扩增的家蚕基因组DNA模板最佳用量为20ng;CELI酶切的20μL反应体系中,加入的最适酶量为0.5μL(本实验室从芹菜中自提的CELI酶10倍稀释液)。本研究初步对TILLING技术应用于家蚕化学诱导突变检测体系进行了优化,为TILLING技术在家蚕功能基因组研究中的应用奠定了基础。

棉花诱变种质Gh14-3-3L基因的Eco-TILLING分析

【目的】为了验证前期建立的诱变体系和鉴定技术在棉花种质资源创制方面的效果。【方法】本实验利用Eco-TILLING技术和测序技术,对诱变获得的棉花材料纤维相关基因进行分析。【结果】与纤维相关的基因Gh14-3-3L在对照和诱变材料上获得了不同的SNP位点变异,在石引150材料上的扩增产物存在1个SNP位点差异,位于320 bp处;石引200材料的扩增产物存在2个SNP位点,分别位于320和380 bp处;石引250材料扩增产物与对照存在1个SNP位点,位于320 bp处,并且经过酶切和测序结果得到了验证。蛋白比对显示其中1个SNP位点的改变导致开放阅读框(ORF)变短,氨基酸数目减少,蛋白结构发生改变,其结构功能有待于进一步研究;连续3年纤维检测数据显示石引200材料与对照之间存在差异性,推断可能与SNP位点变异有关,研究结果将为深入研究SNP位点变异与绒长改变之间的关联性奠定基础。【结论】建立的诱变体系和鉴定技术能够用于棉花种质资源的创制,所得材料在表型性状和分子水平都发生了变化,为深入研究棉花种质资源的创制提供了新的方法和鉴定技术。

甜菜碱对ECO-TILLING分析的影响

为了解决高GC含量基因分析中无法应用ECO-TILLING的问题,以高GC含量的基因组物种水稻为材料,在PCR反应体系中添加0.1 mmol/L的甜菜碱,随后直接利用CEL-I酶酶切。结果表明,添加甜菜碱能够明显提高PCR反应效率,而且不影响CEL-I的酶切活性。

Tilling技术及其在作物遗传育种学中的应用

近10年来,Tilling技术作为一种诱导和鉴定遗传变异的反向遗传学方法逐渐建立起来,并在模式生物拟南芥、玉米、果蝇上得到成功的应用。近来,Tilling技术已进入遗传育种研究领域,并且在功能基因和作物主要性状的研究中显示了巨大的潜力。

TILLING技术在剑麻中的应用前景

定向诱导基因组局部突变(Targeting Induced Local Lesions In Genomes,TILLING)技术自诞生以来在多种模式和非模式植物功能基因组学研究中得到了广泛应用,并获得了大量可用于基础研究的突变体材料和可应用于农作物遗传改良的新种质。这种高通量、低成本的反向遗传学研究方法为剑麻研究带来了新的机遇。目前国内外尚无TILLING 技术应用于剑麻研究的报道,而麻类作物亚麻中则已出现 TILLING 技术成功应用的报道。本文将概述 TILLING 技术的特点,对比其在亚麻中的应用,并结合剑麻 EMS 诱变群体构建策略和剑麻基因组学研究进展,综合探讨该技术在剑麻中的应用前景。

小麦TILLING突变体检测中基因组DNA提取方法的优化

为了优化小麦高通量TILLING突变体扫描所需基因组DNA提取的方法,对利用SDS法、改良SDS法、CTAB法、改良CTAB法、AxyPrep DNA提取试剂盒、Qiagen DNeasy Plant Mini Kit试剂盒以及再生Qiagen硅胶柱方法提取的小麦基因组DNA进行了系统比较。结果表明,尽管7种方法所提取DNA的纯度及琼脂糖凝胶电泳检测结果均良好,但再生Qiagen硅胶柱方法、CTAB法和改良SDS法的DNA浓度显著高于其他方法。根据小麦细胞分裂素氧化酶基因1(TaCKX1)的DNA序列设计引物,以新鲜DNA样品用于PCR扩增大于1 000bp的片段时,后4种方法扩增效果优于前3种方法;DNA在-20℃下保存100d后重新进行PCR扩增时,则只有Qiagen试剂盒和再生Qiagen硅胶柱2种方法提取的DNA能扩增出大于1 000bp的片段。采用本实验室与新西兰坎特伯雷大学合作建立的再生硅胶柱与自配提取液提取小麦基因组DNA,既保证了DNA的高质量,又降低了使用试剂盒的成本,为小麦TILLING库的构建及其他相关试验提供了一种经济有效的DNA提取方法。