TIM-3基因启动子区多态性与胃癌易感的相关性研究

目的探讨中国汉族人群中肿瘤免疫调节基因TIM-3启动子区单核苷酸多态性与胃癌的遗传易感性关联。方法提取190例胃癌患者及216例健康人群外周血基因组DNA,用PCR-RFLP方法检测2组人群中TIM-3基因启动子区-574G/T、-882C/T、-1516G/T3个多态性位点的基因型;各多态位点的基因型与胃癌风险之间的相关性以OR值(odds ratio)及其95%CI(confidence intervals)表示;OR值及其95%CI以非条件Logistic回归模型分析,均经各混杂因素校正后取得;所有的统计检验均为双侧概率检验,统计学分析使用SPSS11.5软件。结果 PCR-RFLP检测结果显示,TIM-3启动子区的3个多态性位点在检测人群中均存在,但3个位点的多态纯合形式在研究人群中几乎没有出现。190例胃癌患者与216例健康对照人群中3个多态性位点的基因率差异均有统计学意义(P<0.05)。经混杂因素的校正后,Logistic回归分析结果显示3个位点的基因型差异均有统计学意义,-574G/T位点:OR=3.92(95%CI:1.40-10.94);-882C/T位点:OR=3.20(95%CI:1.22-8.41);-1516G/T位点:OR=2.32(95%CI:1.23-4.40),P值均<0.05。结论 TIM-3启动子区的基因多态性对于胃癌的发生有着显著的易感关联,虽然该3个位点的多态性纯合基因型存在形式极低,但结果依然提示对于胃癌的发生,TIM-3启动子区的多态性仍是一个重要的易感危险因素。

Tim-3基因4个SNP位点多态性与宁夏地区回族人群类风湿性关节炎易感性的关联性分析

目的:探讨宁夏地区回族人群中Tim-3基因4个单核苷酸多态性(SNP)位点多态性与类风湿性关节炎(RA)易感性的关联性,为RA的早期预防提供理论依据。方法:采用序列特异性引物聚合酶链式反应(SSP-PCR)及限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)2种方法检测113例RA患者及111例健康个体Tim-3基因-574、-882、-1541和4259共4个位点的单核苷酸多态性。结果:宁夏回族健康人群和RA患者中,Tim-3基因-574、-882、-1541基因型频数和等位基因频数的分布差异均无统计学意义(P>0.05),4259位点基因型和等位基因频数分布差异有统计学意义(P<0.05),RA患者组G等位基因频数(6.36%)显著高于健康组(1.58%)。结论:宁夏回族人群Tim-3基因-574、-882、-1541和4259位点存在单核苷酸多态性变异,其中4259T>G的变异与宁夏回族人群RA发生有关。

Tim-3基因多态性与乙型肝炎病毒感染转归的相关性

目的:研究中国汉族人群T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白-3(Tim-3)基因标签单核苷酸多态性(tagSNP)rs11741184C/G和rs13170556A/G位点多态性与乙型肝炎病毒(HBV)感染转归的关系.方法:采用SNaPshot技术检测996例慢性乙型肝炎患者及301例急性HBV感染自限性恢复患者Tim-3基因rs11741184和rs13170556tagSNP位点的多态性,计算其基因型和等位基因分布频率及单体型分布频率.结果:Tim-3基因tagSNPrs11741184位点基因型CC、CG、GG在急性乙型肝炎患者中的分布频率分别为84.39%(254/301)、15.28%(46/301)、0.33%(1/301),在慢性乙型肝炎组中分布频率分别为86.04%(857/996)、13.65%(136/996)、0.3%(3/996),两组比较无统计学差异;Tim-3基因tagSNP rs13170556基因型AA、GA、GG在急性乙型肝炎患者中的分布频率分别为68.77%(207/301)、28.57%(86/301)、2.66%(8/301),慢性乙型肝炎组患者中的分布频率分别为68.07%(678/996)、28.41%(283/996)、3.51%(35/996),两组比较无统计学差异.单体型分析显示,中国汉族人群中存在3种单体型(C-A、C-G、G-A),这3种单体型在急性乙型肝炎组分别为75.08%、16.94%、7.97%,慢性乙型肝炎组分别为75.15%、17.72%、7.13%,3种单体型与HBV感染的转归均无相关性.结论:中国汉族人群中Tim-3基因tagSNPrs11741184和rs13170556位点多态性可能与HBV感染的转归不具相关性.

湖北汉族人群Tim-3基因启动子及编码区的分子突变

目的:检测湖北汉族人群Tim-3基因启动子区和编码区的单核苷酸多态性,寻找Tim-3基因的遗传标记。方法:采用分段扩增直接测序的方法检测60名湖北汉族人Tim-3基因的启动子区、全部的外显子区及部分内含子区,将测序结果与NCBI及HapMap计划库中其他人种的数据进行对比,确定湖北汉族人群Tim-3基因突变的位置、类型和频率。结果:在Tim-3基因启动子区和外显子区共发现9个SNPs,包含5个已报道的SNPs和4个新发现的突变位点。湖北汉族人群中检出的4个SNPs rs4704853、rs10515746、rs4704846、rs9313439与日本人分布相似(P>0.05),与欧洲人及非洲人的分布则有统计学意义(P<0.01)。结论:湖北汉族人群Tim-3基因的SNPs分布有别于其他人种,可为在汉族人群中研究Tim-3基因与疾病关联提供依据。

新疆维吾尔族、汉族人群Tim-3基因rs6555849位点多态性与变应性鼻炎的关联性研究

目的检测新疆地区维吾尔族、汉族人群Tim-3基因内含子区的单核苷酸多态性位点rs6555849的多态性特点及其与变应性鼻炎(AR)的关系。方法采用SNaPshot SNP分型技术,对新疆地区维吾尔族、汉族病例对照600例样本的Tim-3基因rs6555849位点的单核苷酸多态性进行分析,并计算其基因型和等位基因频率。结果 rs6555849位点在新疆人群中已达到遗传平衡。在维吾尔族、汉族人群中rs6555849位点基因型频率及等位基因频率在病例组与对照组之间均无统计学差异(P>0.05)。结论新疆地区维吾尔族、汉族人群中Tim-3基因rs6555849位点在人群中具有群体代表性,其在新疆地区维吾尔族及汉族变应性鼻炎患者及正常人群中的分布无差异,与AR的易感性无关。

TIM-3基因在上皮性卵巢癌中高表达并促进癌细胞的增殖和迁移

目的通过挖掘GEPIA数据库中的基因信息,分析T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(TIM-3)基因在上皮性卵巢癌(EOC)中的表达及作用机制。方法采用GEPIA数据库在线分析TIM-3基因在EOC组织和正常卵巢组织中的表达水平。收集2018年6月~2019年12月在我院实施卵巢手术治疗的82例EOC癌变组织标本和18例正常卵巢组织标本,免疫组织化学法检测标本组织中TIM-3的表达水平,分析TIM-3表达与EOC临床病理参数的相关性;采用Kaplan-MeierPlotter分析TIM-3表达水平与EOC患者生存之间的关系。qRT-PCR法检测卵巢癌组织和正常组织标本TIM-3和Wnt1 mRNA表达水平及相关性。采用pMAGic 4.0质粒转染构建TIM-3沉默卵巢癌SKOV3细胞系,将细胞分为SKOV3组(未转染的SKOV3细胞系)、沉默阴性对照组(SKOV3+NCsiRNA组:转染pMAGic 4.0 NC siRNA质粒的SKOV3细胞系)和沉默TIM-3组(SKOV3+TIM-3 siRNA组:转染pMAGic 4.0 TIM-3 siRNA质粒的SKOV3细胞系);采用pcDNA3.1质粒转染构建TIM-3过表达卵巢癌SKOV3细胞系,将细胞分为SKOV3组、过表达阴性对照组(pcDNA NC组:转染pcDNA3.1质粒的SKOV3细胞系)和过表达TIM-3组(pcDNA TIM-3组:转染pcDNA3.1 TIM-3质粒的SKOV3细胞系)。MTT法检测细胞增殖能力,Annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡能力,划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力,TOPflash/FOPflash双荧光素酶报告基因实验检测Wnt/β-catenin通路活性,qPCR检测Wnt/β-catenin信号通路中转录因子TCF-7、TCFL-2及靶基因CD44的mRNA水平,Westernblot检测SKOV3细胞中MMP-9,CD44、Wnt1、β-catenin及E-cad蛋白表达。结果TIM-3在正常卵巢组织中呈阴性表达,在EOC组织中呈阳性表达,EOC组织中TIM-3阳性表达率(84.14%)显著高于正常卵巢组织(16.67%,P<0.05)。TIM-3表达与FIGO分期、组织分化程度及淋巴结是否转移有关(P<0.05),与年龄、病理类型无关(P>0.05)。且TIM-3与Wnt1水平呈正相关(P<0.05)。沉默TIM-3基因后,Wnt/β-catenin通路活性受到抑制,SKOV3细胞增殖、迁移和侵袭能力显著降低(P<0.05),凋亡能力显著升高(P<0.05),转录因子TCF-7、TCFL-2及靶基因CD44的mRNA水平显著下调,细胞MMP-9,CD44、Wnt1、β-catenin蛋白水平均显著下调,EMT相关蛋白E-cad水平显著上调(P<0.05)。过表达TIM-3基因后,Wnt/β-catenin通路活性被激活,SKOV3细胞增殖、迁移和侵袭能力显著升高(P<0.05),凋亡能力显著降低(P<0.05),转录因子TCF-7、TCFL-2及靶基因CD44的mRNA水平显著上调,细胞MMP-9,CD44、Wnt1、β-catenin蛋白水平均显著上调,EMT相关蛋白E-cad水平显著下调(P<0.05)。结论TIM-3在EOC组织中高表达,可促进卵巢癌细胞的恶性生物学行为,其机制可能与Wnt/β-catenin信号通路的激活有关。

基于家系的Tim-3基因多态性与儿童变应性哮喘的关联研究

目的以家系资料为基础，利用遗传不平衡原理探讨染色体5q33．2区Tim-3基因启动子两个多态性位点rs10053538和rs10515746与中国湖北地区汉族儿童变应性哮喘的关系。方法应用限制性片段长度多态性技术结合测序方法，分析了118个儿童变应性哮喘核心家系Tim-3基因rs10053538和rs10515746的基因型；采用基于家系的关联分析方法，包括单体型相对风险分析（HRR）和传递不平衡检验（TDT），分析基因分型数据；应用Transmit软件构建单体型并进行单体型关联分析。结果118个核心家庭HRR分析显示Tim-3基因启动子区两个多态性位点rs10053538和rs10515746不使病人具有更高的发病风险（X^2=2．430，P〉0．05；）（X^2=1．368，P〉0．05）。118个满足经典TDT分析的核心家庭中，杂合子父母传递给患病子代的等位基因频率不比预期值高（X^2=2．042，P〉0．05；X^2=0．750，P〉0．05）。Transmit双位点单体型分析也未见父母传递给子女各个单体型的观察值和期望值有明显差异（P〉0．05）。结论中国湖北地区汉族人群中，Tim-3基因启动子区两个多态性位点rs10053538和rs10515746与儿童变应性哮喘不具有相关性。

人Tim-3基因克隆及其转基因细胞的构建

目的克隆人Tim-3基因,并构建含有该目的基因的重组真核表达载体,获得稳定表达人Tim-3分子的L929基因转染细胞。方法采用RT-PCR方法从人外周血T淋巴细胞中克隆出Tim-3基因,通过双酶切(XhoI,Sa-lI)装入真核表达载体pIRES2-EGFP中,脂质体法转染L929细胞,72 h后加入G418进行筛选,挑选出能稳定表达Tim-3蛋白的L929细胞株。结果构建了用于表达的含Tim-3基因的重组真核表达载体,经脂质体转染L929细胞,继而经RT-PCR和流式细胞术表型检测,筛选出稳定表达人Tim-3蛋白的L929转基因细胞。结论构建了含人Tim-3基因重组真核表达载体和稳定表达人Tim-3蛋白的细胞株,为该基因功能的后续研究和单克隆抗体的研制奠定了基础。

人Tim-3基因真核表达载体的构建及表达

目的:为了构建可在真核细胞中高效表达人Tim-3(hTim-3)的真核表达质粒,以便用于hTim-3肿瘤免疫治疗研究。方法:取健康人外周血的单个核细胞,用高保真聚合酶扩增hTim-3基因,先进行hTim-3基因的亚克隆,用BglⅡ和SalⅠ限制性内切酶切下带有酶切位点的hTim-3基因,最终构建hTim-3基因的真核表达质粒pEGFP-N1-hTim-3。用脂质体方法转染质粒至肝癌细胞SMMC7721和巨噬细胞U937中。48h后荧光显微镜观察转染细胞绿色荧光表达情况,初步判断转染效率。结果:酶切和测序鉴定证实目的基因hTim-3正确插入到真核表达载体pEGFP-N1中,转染肝癌细胞SMMC7721和巨噬细胞U937后,在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达。结论:成功构建了可在真核细胞中高效表达hTim-3基因的真核表达质粒pEGFP-N1-hTim-3,为进一步研究hTim-3的肿瘤免疫治疗奠定了基础。

TIM-3及STAT3基因在结直肠腺癌中的研究进展

T细胞免疫球蛋白黏蛋白3(TIM-3)基因异常在肿瘤发生发展及预后中起重要作用。研究表明,TIM-3基因在胃癌、大肠癌、肝癌、肺癌等多种肿瘤中表达上调,与肿瘤发生发展及低生存率、易复发、预后差相关。信号转导子和激活子3(STAT3)在细胞生长、增殖、分化和凋亡中起重要作用。STAT3高表达于结直肠腺癌,可诱导肿瘤细胞增殖和分化,抑制肿瘤细胞凋亡,促进肿瘤组织血管生成及肿瘤细胞转移,导致肿瘤恶化。本文对TIM-3及STAT3基因在结直肠癌中的研究进展进行综述。

新疆维吾尔族健康人中Tim-3基因结构分析

目的检测新疆维吾尔族人中Tim-3基因启动子区和非翻译区单核苷酸多态性(SNP),寻找Tim-3基因的遗传标记。方法采用分段扩增直接测序法,检测32名正常新疆维吾尔族人Tim-3基因5′启动子3kb和3′端1kb的长度—筛查SNPs,将测序结果与NCBI数据库中其他人种进行比较,确立新疆维吾尔族人中Tim-3基因突变的位置、类型及频率。结果在Tim-3基因启动子区和非翻译区发现12个SNP位点,有8个高频SNP位点在NCBI的dbSNP数据库中已存在,4个是新发现的低频SNP;各个SNPs的基因型和等位基因分布经Hardy-Wein-berg平衡定律检验,均达到遗传平衡,具有群体代表性。32例SNPs的分布及频率未见明显的统计学差异。结论新疆维吾尔族人中Tim-3基因SNP分布具有种族和地域差异,可为研究维、汉族人Tim-3基因与疾病相关性提供依据。

新疆维吾尔族、汉族人群TIM-3启动子区rs10053538与过敏性鼻炎的相关性

目的探讨新疆维吾尔族、汉族TIM-3基因的单核苷酸多态性位点rs10053538的多态性及其与过敏性鼻炎的关系。方法采用SNaPshot SNP分型技术检测新疆地区维、汉族正常及过敏性鼻炎各150例TIM-3启动子区rs10053538的单核苷酸多态性,计算基因型和等位基因频率。结果新疆地区维吾尔族、汉族正常人群TIM-3基因启动子区rs10053538位点基因型及其频率TT、TG、GG分别为0.86、0.13、0.01及0.89、0.1、0.01,过敏性鼻炎组的频率分别为0.86、0.14、0及0.87、0.13、0,其基因型和等位基因频率均与对照组差异无统计学意义(P值>0.05)。结论新疆维吾尔族、汉族人群TIM-3基因启动子区rs10053538与过敏性鼻炎之间不存在相关性。

Tim-3在免疫相关性疾病中的作用

Th1和Th2细胞是机体免疫调节的核心,二者细胞数量和功能的失衡可导致自身免疫性疾病、过敏性疾病等多种疾病。同时,Th1和Th2也参与了免疫耐受、肿瘤免疫等过程。Tim-3为Tim基因家族中的一个重要成员,特异性地表达于活化的Th1细胞表面。研究表明,Tim-3与其配体galectin-9结合给T细胞提供一种负性刺激信号,下调Th1细胞的反应,在很多慢性炎症性疾病中起了重要作用。动物模型和人类基因数据也表明Tim-3的位点和基因多态性与免疫性疾病相关。本文着重阐述Tim-3在自身免疫性疾病、过敏性疾病、免疫耐受和肿瘤免疫性疾病中的作用,以期进一步阐明这些疾病的发病机制,探索新的防治策略。

人Tim-3启动子的克隆及其真核报告质粒的构建

目的克隆人Tim-3基因5′端非编码区处具有启动子活性的片段,构建其真核报告质粒,为进一步研究Tim-3表达调控奠定基础。方法以人基因组DNA为模板,针对人Tim-3启动子5′端非编码区处包括翻译起始点ATG和转录起始点TSS在内的-898^+242片段,设计特异性引物,PCR扩增该片段,命名为Tim-3P2,经双酶切后克隆入pGL3-Basic载体SacⅠ、XhoⅠ位点,构建pGL3-Tim-3P2荧光素酶报告质粒,与内参照pRL-TK用脂质体法瞬时共转染COS-7、RAW264.7和B16细胞系,通过双荧光素酶活性检测确定其启动子活性。结果pGL3-Tim-3P2经PCR、双酶切及DNA测序分析鉴定正确无误;pGL3-Tim-3P2转染RAW264.7和B16细胞(两种细胞均可表达内源性Tim-3)24 h和48h,双荧光素酶活性检测显示其启动子相对活性约为pGL3-Basic空载体的2倍;而pGL3-Tim-3P2转染不表达内源性Tim-3的COS-7细胞后检测不到荧光素酶活性。结论成功克隆并构建含有人Tim-3启动子的真核报告质粒,该载体具有特异性Tim-3启动子活性,为进一步研究Tim-3表达调控奠定了基础。