TIMP1基因对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞HEPApiC凋亡的影响及机制研究

目的探讨基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)基因对肺炎链球菌诱导的人肺泡上皮细胞HEPApiC凋亡的影响及其可能的机制。方法体外培养人肺泡上皮细胞HEPApiC,采用肺炎链球菌感染HEPApiC细胞,实时荧光定量PCR(QPCR)和Western blot检测细胞中TIMP1的表达水平。将HEPApiC细胞分为4组,空白对照组(未做任何处理的细胞)、感染组(肺炎链球菌感染的细胞)、阴性对照组(转染siRNA control+肺炎链球菌感染的细胞)和干扰组(转染TIMP1 siRNA+肺炎链球菌感染的细胞)。CCK-8法检测各组HEPApiC细胞活力,流式细胞术检测各组HEPApiC细胞凋亡情况,Western blot检测细胞中B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达水平,ELISA检测上清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)的含量。结果肺炎链球菌感染后HEPApiC细胞中TIMP1 mRNA和蛋白表达水平均明显上调。转染TIMP1 siRNA后HEPApiC细胞中TIMP1 mRNA和蛋白表达水平均明显下调。感染组细胞凋亡率、Bax表达水平、TNF-α、IL-1β和IL-6含量均明显高于空白对照组(P<0.05),而细胞活力和Bcl-2表达水平低于空白对照组(P<0.05);干扰组细胞凋亡率、Bax表达水平、TNF-α、IL-1β和IL-6含量均明显低于感染组和阴性对照组(P<0.05),而细胞活力和Bcl-2表达水平高于感染组和阴性对照组(P<0.05)。结论敲低TIMP1基因表达能够抑制肺炎链球菌诱导的HEPApiC细胞凋亡,其作用机制可能与抑制炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达有关。

TIMP1在胃癌中的表达及作用机制的多数据库分析和实验研究

目的:探讨TIMP1在胃癌中的表达及作用机制。方法:应用Oncomine、GEPIA数据库分析TIMPs家族成员在胃癌及正常组织中的差异性表达,选择TIMP1为研究对象。GEPIA进一步分析TIMP1与胃癌病理分期相关性,Kaplan-Meier绘图仪分析TIMP1表达水平与胃癌患者生存预后的关系。应用CRISP/Cas9技术敲除TIMP1基因,CCK-8实验法检测细胞增殖情况,RT-PCR检测胃癌细胞AGS组与TIMP1基因敲除组的抗凋亡基因Bcl-2及促凋亡基因c-Myc的mRNA表达水平。应用DAVID数据库进行GO和KEGG分析。结果:Oncomine、GEPIA数据库分析发现胃癌组织中TIMP1表达水平更高,差异有统计学意义(P<0.01);TIMP1表达量与胃癌病理分期呈负相关;Kaplan-Meier绘图仪分析显示TIMP1高水平表达的胃癌患者较低水平表达胃癌患者生存预后更差。TIMP1基因敲除后,胃癌细胞增殖明显减少,抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表达水平下降,促凋亡基因c-Myc mRNA表达水平上升。GO分析结果显示,TIMP1主要富集在细胞粘附分子结合、细胞外基质及细胞外结构组织等基因功能上;KEGG分析发现,TIMP1主要涉及粘着斑、癌症中的蛋白多糖等信号通路。结论:TIMP1在胃癌中呈高水平表达,与胃癌的病理分期、生存预后相关;敲除基因后,肿瘤细胞增殖减少,有望成为新的胃癌治疗靶点。

槲皮素抑制小鼠血吸虫病肝组织即早基因和基质金属蛋白酶组织抑制因子1的表达

分别运用槲皮素及吡喹酮治疗小鼠日本血吸虫肝纤维化。槲皮素治疗后小鼠肝纤维化程度减轻,肝组织中即早基因c-fos与c-jun及基质金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP1)和Ⅰ、Ⅲ型胶原含量均明显低于感染对照组;与吡喹酮组相比,c-junmRNA、Ⅰ、Ⅲ型胶原含量明显降低,而c-fosmRNA、TIMP1含量无显著改变,提示其远期抗血吸虫肝纤维化效果优于吡喹酮。

反义TIMP_1基因转染Ito细胞后对其ECM代谢的影响

目的 探讨反义TIMP1基因对Ito细胞 (贮脂细胞 )金属蛋白酶的表达和细胞外基质 (ECM )降解的影响。方法 将大鼠全长TIMP1cDNA反向插入哺乳表达载体pCI neo中 ,构建反义TIMP1基因真核表达载体 ,用脂质体介导的方法 ,将反义TIMP1基因导入Ito细胞株CFSC 2G中 ,选择稳定转染的Ito细胞株培养 ,采用RT PCR、原位杂交、免疫组化及RIA等方法 ,观察TIMP1mRNA和蛋白、MMP1mRNA和蛋白、α1(Ⅲ )mRNA、FN蛋白表达及细胞培养上清中PCI、PCⅢ、HA、LN水平的变化。结果 反义TIMP1基因能明显地抑制Ito细胞中TIMP1mRNA和蛋白的高表达 (P <0 0 1)。转基因细胞中α1(Ⅲ )mRNA、MMP1mRNA、FN蛋白的表达与未转基因细胞比较无明显变化 (P >0 0 5 )。转基因后Ito细胞培养上清中PCI、PCⅢ、HA、LN水平明显低于未转基因细胞 (P <0 0 1)。结论 反义TIMP1基因可以抑制贮脂细胞内源性TIMP1产生 ,但未影响MMP1的表达 。

小鼠脑缺血再灌注损伤不同时间点基因表达谱的变化研究

目的:通过生物信息学方法研究小鼠脑缺血再灌注损伤(CIRI)所致的损伤模型的基因表达谱变化,寻找疾病相关的关键基因。方法:从Gene Expression Omnibus(GEO)中下载关于小鼠脑损伤GSE23160时间序列基因表达谱芯片的原始数据,分析皮质脑组织样本和纹状体脑组织样本在缺血再灌注不同时间点基因表达谱的差异,并对差异表达基因进行GO和KEGG功能富集分析。再通过聚类分析挑取表达趋势明显的差异基因进行免疫细胞浸润分析和关键基因分析。并在大鼠CIRI模型上对显著差异基因进行验证。结果:免疫细胞浸润分析发现CIRI过程中出现肥大细胞和巨噬细胞浸润。CIRI过程中的差异基因主要参与愈伤反应、炎性反应和信号转导通路等。在2个组织样本的不同再灌注时间点Timp1和Gpr84基因表达都发生了显著上调。大鼠CIRI模型进一步验证了Timp1和Gpr84基因的上调表达。结论:Timp1和Gpr84基因可能是脑缺血再灌注过程中的关键基因。

通心络胶囊对载脂蛋白E基因敲除小鼠冠状动脉粥样硬化的影响及其机理研究

目的通过通心络胶囊(以下简称"通心络")对载脂蛋白E基因敲除小鼠[ApoE(-/-)]冠状动脉斑块和心肌病理组织学及其循环内皮细胞(CEC)、内皮素(ET)、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、基质金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP1)等指标的干预变化,探究其治疗冠心病(CHD)动脉粥样硬化(AS)的疗效机制。方法将40只ApoE(-/-)小鼠作为实验组,建立冠状AS模型,随机分为模型组、辛伐他汀组和通心络高、中、低剂量组,分别给予相应药物干预8周;另选8只同系的小鼠作为正常对照组。观察各组小鼠冠状动脉斑块和心肌病理组织学及其CEC、ET、MMP-1、MMP-9、TIMP1等指标的变化。结果模型组小鼠冠状动脉病变主要位于心肌内的小分支、心肌细胞、心肌间质,均分为6.33±1.48。辛伐他汀组均分为2.62±2.25;通心络低、中、高剂量组均分为4.5±1.71、3.12±1.81、2.38±2.34。各给药组与模型组比较,P<0.05或P<0.01;通心络中、高剂量组与辛伐他汀组比较,P>0.05。模型组第4周开始,血中CEC显著增多,与正常组相比,P<0.01,与通心络高剂量组在造模后第4、8、12周相比,P<0.05或P<0.01,与中剂量组在造模后第4、12周相比,P<0.05。模型组小鼠血清ET含量高于正常组,P<0.05,与通心络3个剂量组相比,P<0.01。通心络高剂量组MMP-1和MMP-9水平均低于模型组,而TIMP1水平高于模型组,P<0.05或P<0.01,通心络中剂量组MMP-9水平低于模型组,P<0.05。结论通心络具有抗冠状AS和稳定斑块的作用,其机制可能与改善血管内皮细胞功能障碍(EDF)和抑制血管重构相关。

The Expression of <i>TIMP</i>1, <i>TIMP</i>2, <i>VCAN</i>, <i>SPARC</i>, <i>CLEC</i>3<i>B</i>and <i>E</i>2<i>F</i>1 in Subcutaneous Adipose Tissue of Obese Males and Glucose Intolerance

We investigated the expression of TIMP1, TIMP2, SPARC, VCAN, and CLEC3B genes, encoded matricellular proteins with pleiotropic functions, and glucose intolerance in obese male subjects with normal and impaired glucose tolerance. The purpose of this study was to examine the association between the gene expressions and glucose intolerance in obesity. The results indicate that obesity leads to significant increase of TIMP1, TIMP2, E2F1 and CLEC3B gene expressions in subcutaneous adipose tissue, especially TIMP2 gene. However, more significant increase of the expression of TIMP1 and TIMP2 was found in adipose tissue of obese patients with glucose intolerance. No significant changes were found in the expression of VCAN and SPARC genes in adipose tissue of obese subjects with normal glucose tolerance but increased in the group of obese subjects with glucose intolerance. At the same time, the E2F1 and CLEC3B gene expressions were decreased in adipose tissue of obese patients with glucose intolerance. Results of this study provide evidence that changes in the expression of genes encoded TIMP1, TIMP2, VCAN, SPARC, E2F1 and CLEC3B in subcutaneous adipose tissue of obese individuals associate with glucose intolerance.

HIF-1α siRNA对非小细胞肺癌A549细胞TIMP1、MMP1表达的影响

目的探讨HIF-1α基因沉默对非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞基质金属蛋白酶1(matrix metalloproteinase 1,MMP1)、基质金属蛋白酶抑制剂1(matrix metalloproteinase inhibitor,TIMP1)表达的影响。方法将siRNAHIF-1α质粒载体稳定转染至A549细胞中,于缺氧环境下培养。应用MMT法和Transwell试验分别检测转染细胞的增殖、迁移和侵袭能力。应用qRT-PCR和蛋白免疫印迹分别检测转染细胞内TIMP1、MMP1 mRNA和蛋白表达水平。结果与Control组相比,A549组HIF-1αmRNA和蛋白表达显著增加(均P<0.05)。与Blank组和si-NC组相比,si-HIF-1α组HIF-1αmRNA表达水平显著降低(P<0.05)。与Blank组相比,si-HIF-1α组在转染24、48和72 h后细胞增殖率均显著降低(均P<0.05)。与Blank组相比,si-HIF-1α组A549细胞在转染24 h后的迁移和侵袭数量均显著降低(P<0.05)。与Blank组相比,si-HIF-1α组细胞内MMP1表达水平显著降低,而TIMP1表达水平显著增加(均P<0.05)。结论在缺氧状态下,HIF-1αsiRNA靶向沉默HIF-1α在A549细胞内的表达,并可以通过下调MMP1表达和上调TIMP1的表达而抑制细胞的增殖、迁移和侵袭。

TIMP1基因重组真核表达质粒的构建及其在MCF-7细胞中的表达

目的构建3种TIMP1基因重组真核表达质粒,并在人乳腺癌MCF-7细胞中表达。方法将TIMP1基因分别插入3种真核表达载体pcDNA3.1(+)、pVAXⅠ和pEGFP-C1,构建3种重组表达质粒pcDNA3.1(+)-TIMP1、pVAXⅠ-TIMP1和pEGFP-C1-TIMP1,转染MCF-7细胞,采用Real-time PCR和Western blot法检测TIMP1基因在MCF-7细胞中的表达。结果 3种重组表达质粒经双酶切及测序证实构建正确;重组表达质粒pEGFP-C1-TIMP1转染MCF-7细胞48 h后,在荧光显微镜下可观察到绿色荧光,而pcDNA3.1(+)-TIMP1和pVAXⅠ-TIMP1转染的细胞则观察不到绿色荧光;在转染的MCF-7细胞中,TIMP1基因mRNA转录水平和蛋白表达水平从高到低依次为pcDNA3.1(+)-TIMP1、pVAXⅠ-TIMP1和pEGFP-C1-TIMP1。结论已成功构建了3种TIMP1基因重组真核表达质粒,其在MCF-7细胞中的表达量有差异。