猪种布鲁氏菌TIR结构域蛋白的生物信息学分析、重组表达及蛋白互作研究

【目的】本研究以猪种布鲁氏菌Toll/白介素-1受体(TIR)结构域蛋白(Brucella suis TIR domain containing protein,Bs-TDCP)为研究对象,进行基因克隆、生物信息学分析及蛋白互作研究,为后续开发适合动物或人类使用的有效布鲁氏菌疫苗奠定基础。【方法】利用GenBank数据库查找黑腹果蝇髓样分化因子88(Dm-MyD88)和人MyD88(Hs-MyD88)基因序列,设计特异性引物进行基因序列扩增。根据猪种布鲁氏菌测序结果,获得Bs-TDCP基因序列。通过ExPASy、SWISS-MODEL、TMHMM、SMART等在线工具分析Bs-TDCP蛋白理化性质、二级和三级结构、跨膜及功能结构域,并进一步研究Bs-TDCP蛋白与Toll样受体(TLRs)信号通路的关键胞内配体MyD88分子之间的蛋白串扰。【结果】猪种布鲁氏菌TIR结构域蛋白Bs-TDCP基因的开放阅读框(ORF)大小为828 bp,编码275个氨基酸,其中丙氨酸占12.7%,分子式为C_(1345)H_(2196)N_(390)O_(424)S_(6),Bs-TDCP蛋白分子质量为35.85 ku,理论等电点为9.37,不稳定指数为50.44,属于不稳定疏水性蛋白,不包含跨膜结构域和信号肽序列(SPS),但其具有典型的TIR结构域,Bs-TDCP蛋白二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲组成,占比分别为77.45%、8.36%、2.91%和11.27%。重组蛋白Bs-TDCP(rBs-TDCP)、重组蛋白Dm-MyD88(rDm-MyD88)和重组蛋白Hs-MyD88(rHs-MyD88)亲和纯化效果良好。蛋白体外结合试验结果表明,不含His标签的Bs-TDCP(rBs-TDCP^(△))与MyD88分子之间存在蛋白互作。【结论】rBs-TDCP^(△)分别与rDm-MyD88、rHs-MyD88配体存在一定程度的蛋白互作,本研究结果为开发供人类使用的新型布鲁氏菌疫苗提供理论参考。

布鲁氏菌TIR结构域蛋白TcpB的研究进展

布鲁氏菌病是由布鲁氏杆菌感染引起的一种人兽共患病,其感染的重要特征是机体的免疫功能受到抑制。布鲁氏菌TIR结构域蛋白TcpB具有多种免疫抑制功能,在逃避宿主免疫应答中具有重要作用。谨就布鲁氏菌TcpB的基本结构、免疫调节功能和分子机制的研究进展综述,以便理解TIR结构域蛋白TcpB在布鲁氏菌致病中介导的免疫抑制机制,有助于更好理解布鲁氏菌的致病机理,为诊治布鲁氏菌病提供新思路。

基于TIR结构的汽车远光光学设计及其分析

得益于低碳绿色生活概念的推广以及国家政策的大力支持,新能源汽车得到越来越广泛的普及,而车灯作为汽车零部件的重要组成部分,主要功能是照明,还有美化整车造型的作用,车灯既影响汽车驾驶的安全性,也影响汽车的美观。以往车灯的造型设计更多体现在信号灯上,而远近光灯多为规则的四方形或圆形,基于TIR结构设计一款由多颗LED作为光源的远光灯,该远光灯具有较好的散热性能,可延长LED的使用寿命。

植物TIR-NB-LRR类型抗病基因各结构域的研究进展

植物抗病反应是一个多基因调控的复杂过程,在这个过程中R基因发挥了非常重要的作用。根据其氨基酸基序组成以及跨膜结构域的不同,R基因可以分为多种类型,其中NBS-LRR类型是植物基因组中最大的基因家族之一。TIR-NB-LRR类型的抗病基因又是NB-LRR类型中的一大类,也是目前抗病基因研究的热点。该文总结了TIR-NB-LRR类型抗病基因各个结构域的功能和相关的研究进展。相关研究表明,TIR结构域主要通过自身或异源的二聚体化介导抗性信号的转导,但也有部分研究表明,该结构域可能参与病原菌的特异性识别。NBS结构域常被认为具有"分子开关"的功能,它可以通过结合ADP或ATP来调节植物抗病蛋白的构象变化,从而调节下游抗病信号的传导。LRR结构域在植物与病原菌互作的过程中可以通过与病原菌的无毒蛋白直接或间接互作来特异识别病原菌。也有研究发现,LRR结构域具有调节信号传导的功能。这些信息将为研究植物抗病机理提供理论依据,也为将来通过基因编辑技术对作物进行定向抗病育种提供思路。

伊伐布雷定联合常规药物治疗小儿病毒性心肌炎的临床效果分析

目的:分析伊伐布雷定联合常规药物治疗小儿病毒性心肌炎(VMC)的临床效果。方法:选取2020年7月—2022年7月淮安市妇幼保健院收治的VMC患儿94例作为研究对象,依据随机数字表法分为观察组与对照组,各47例。对照组给予常规治疗,观察组在对照组基础上应用盐酸伊伐布雷定治疗。比较两组治疗效果。结果:观察组治疗总有效率、白细胞介素-4水平高于对照组,血清γ干扰素、单核细胞趋化蛋白-1、血清淀粉样蛋白、心肌肌钙蛋白T、B型钠尿肽前体水平以及外周血Toll样受体3(TLR3)、β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TRIF)、核因子-κBp65表达量低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。两组不良反应发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:伊伐布雷定联合常规药物治疗VMC的效果较好,可通过抑制TLR3/TRIF信号通路减轻炎性反应,改善患者心功能,且安全性高。

TLR2和TLR4的TLR/IL-1 receptor结构与功能

Toll样受体（Toll like receptor，TLR）是架接固有免疫和适应性免疫的桥梁。迄今为止，已鉴定的人TLR有10种，分别命名为TLR1-TLR10，TLR是一种I型跨膜蛋白，由胞外富含亮氨酸重复序YtJ（LRR）结构域，胞内保守的Toll／IL-1受体（TIR）结构域和跨膜结构域构成。TLRs在识别病原体相关分子模式后，其信号的特异转导主要取决于TLRs的TIR功能域与下游接头分子的TIR功能域的特异相互作用。然而，TLR2和TLR4的TIR功能域在其与下游接头分子Mal和MyD88相互作用、以及TLRs同源或异源二聚化方面的作用模式存在明显的差异。本文就TLR2和TLR4的TIR结构与功能进行简要综述，有助于我们进一步了解TLRTIR功能域与下游接头分子的相互作用。

尼罗罗非鱼TIRAP基因克隆、组织表达及其在无乳链球菌、脂多糖和聚肌胞苷酸刺激下的免疫应答

为研究包含TIR结构域的接头蛋白(TIR domain-containing adaptor protein,TIRAP)基因在TLR信号介导的先天免疫中的调控作用,通过反转录-聚合酶链式反应和分段扩增获得了尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus TIRAP基因的cDNA全长,并对其生物信息学进行分析,利用RT-qPCR法分析TIRAP在健康鱼各组织中的表达情况,以及在无乳链球菌Streptococcus agalactiae、脂多糖(LPS)和聚肌胞苷酸(Poly I:C)刺激后不同组织不同时间点的表达量变化。结果表明:TIRAP cDNA全长2900 bp,开放阅读框为816 bp,可编码291个氨基酸;系统进化分析显示,尼罗罗非鱼与快乐东方鲷Astatotilapia calliptera TIRAP的亲缘关系较近;TIRAP在尼罗罗非鱼11个组织(肝、皮肤、心脏、肾、胃、鳃、脑、脾、肠、血液和肌肉)中均有表达,其中肌肉中表达量最高(P<0.05),胃中表达量相对较低;人工感染无乳链球菌引起TIRAP基因在肠和肾中上调表达,均在注射后1 d时表达量达到最大值;LPS和Poly I:C刺激引起TIRAP基因在肝、脾和肾中上调表达,但在肠中表达量均低于对照组(0 h)。研究表明,无乳链球菌、LPS和Poly I:C均能诱导TIRAP基因表达,TIRAP基因参与了尼罗罗非鱼免疫应答反应,暗示TIRAP在先天免疫中发挥作用。

miR-27a-3p介导TLR4/TRIF信号通路对脑出血大鼠神经的保护作用

目的分析miR-27a-3p介导Toll样受体(TLR)4/β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TRIF)信号通路对脑出血大鼠神经的保护作用。方法选取80只SD级雄性大鼠,20只作为正常组,其余60只建立大鼠脑出血模型后随机分为模型组、上调组、下调组各20只,做miR-27a-3p转染,鉴定miR-27a-3p转染率、脑组织中肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-1β含量、神经功能缺损情况、TLR4/TRIF信号通路蛋白表达情况。结果与模型组相比,上调组miR-27a-3p表达量升高,下调组miR-27a-3p表达量降低,具有统计学差异(P<0.05),证明miR-27a-3p转染成功。相比于正常组,模型组、上调组、下调组TNF-α、IL-1β含量、神经功能缺损评分、TLR4、TRIF、TRAM含量升高,具有统计学差异(P<0.05);相比于模型组,下调组TNF-α、IL-1β含量、神经功能缺损评分、TLR4、TRIF、TRAM含量升高,上调组TNF-α、IL-1β含量、神经功能缺损评分、TLR4、TRIF、TRAM含量降低,具有统计学差异(P<0.05);且下调组TNF-α、IL-1β含量、神经功能缺损评分、TLR4、TRIF、TRAM含量高于上调组,具有统计学差异(P<0.05)。结论miR-27a-3p可介导TLR4/TRIF信号通路对脑出血大鼠神经起到保护作用。减少大鼠脑内炎症反应。

双歧杆菌在过敏性哮喘治疗中的作用机制研究进展

过敏性哮喘是一种由多种炎性因子介导的气道慢性炎症,以气道高反应和可逆性呼气气流受限为临床特征。肠道菌群失调可能与过敏性哮喘的发生有关。双歧杆菌是一种肠道有益菌。双歧杆菌可以通过色氨酸代谢途径,促进芳基烃受体(AHR)配体表达,调节辅助性T细胞/调节性T细胞平衡,抑制气道的炎症反应;AHR可通过抑制活性氧簇(ROS)-核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3通路,减轻气道炎症反应及黏液分泌,缓解过敏性哮喘的发展。双歧杆菌可促进短链脂肪酸的生成,下调核因子-κB信号通路、抑制转化生长因子/Smads信号通路及上调G蛋白受体41和G蛋白受体43表达,减轻气道炎症、降低气道高反应,缓解过敏性哮喘的发展。双歧杆菌可抑制Toll样受体3/β干扰素TIR结构域衔接蛋白信号通路,减轻气道炎症及结构重塑,缓解过敏性哮喘的发展。

鼠李糖乳杆菌GR-1介导TRIF/NF-κB信号通路抗大肠杆菌诱导奶牛子宫内膜上皮细胞炎性损伤

为探讨鼠李糖乳杆菌GR-1(Lactobacillus rhamnosus GR-1,L.rhamnosus GR-1)对大肠杆菌(Escherichia coli)诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞(Bovineendometrialepithelialcells,BEECs)炎性损伤的保护作用及其机制,本研究建立BEECs细胞炎性损伤模型,利用Real-time qPCR和Western blot技术,观察在BAY11-7082或siRNA干预前后,L.rhamnosus GR-1对E.coli触发的信号通路及炎性因子表达的影响。结果显示,L.rhamnosusGR-1可以显著抑制由E.coli引起的NF-κB和TRIF通路的激活及炎性因子的表达,在BAY11-7082干预后,E.coli诱导的NF-κB通路的激活及炎性因子的表达得到了显著的抑制。同样,在添加TRIF siRNA后,E.coli诱导的TRIF mRNA及炎性因子的表达水平也显著下降,产生和L.rhamnosus GR-1一致的抗炎效果。本研究表明L.rhamnosus GR-1可通过介导NF-κB和TRIF通路调节E.coli诱导的BEECs的炎性损伤,为奶牛子宫内膜炎的防治提供有益参考。

基于TLR3/TRIF通路分析重组人干扰素α2b联合炎琥宁对病毒性肺炎患儿的疗效与作用机制

目的基于Toll样受体3(TLR3)/β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TRIF)通路分析重组人干扰素α2b联合炎琥宁对病毒性肺炎(VP)患儿的疗效与作用机制。方法选取2020年1-5月收治的VP患儿200例,根据治疗方法不同分为观察组和对照组,每组100例。对照组给予重组人干扰素α2b治疗,观察组在对照组基础上加用炎琥宁治疗。治疗7 d后,比较2组临床疗效、临床症状改善时间、住院时间及不良反应发生情况,比较2组治疗前后外周血单个核细胞(PBMC)中TLR3/TRIF通路相关因子[TLR3、TRIF、核因子-κBp65(NF-κBp65)]mRNA表达量、血清免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM)水平及呼吸功能[呼吸频率(RR)、潮气量(VT)、呼气达峰时间(TPTEF)/呼气时间(TE)]。结果观察组临床总有效率高于对照组,退热时间、咳嗽消失时间、呼吸困难消失时间、肺啰音消失时间及住院时间均短于对照组(P<0.01)。治疗7 d后,观察组PBMC中TLR3、TRIF、NF-κBp65 mRNA表达量以及RR低于对照组,血清IgG、IgA、IgM水平以及VT、TPTEF/TE高于对照组(P<0.05)。2组不良反应总发生率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论重组人干扰素α2b联合炎琥宁治疗VP患儿的效果显著,可改善临床症状、呼吸功能,提高免疫球蛋白含量,其作用机制与抑制TLR3/TRIF通路活化有关。

MyD88和TRIF在乳房和乳房外Paget病皮损组织中的表达

目的 研究髓样分化因子88(MyD88)和β-干扰素TIR结构域衔接因子(TRIF)在乳房和乳房外Paget病(MPD和EMPD)中的表达,并在显微镜下观察染色阳性细胞;采用Pearson相关性分析法分析MyD88与TRIF的相关性。方法 采集20例MPD和20例EMPD患者皮损组织石蜡标本并经临床及组织病理学确诊。以10例手术患者切除的良性组织病灶外2 cm并经病理学确认为正常皮肤组织作对照,采用免疫组化法检测MyD88和TRIF表达水平。结果 MPD和EMPD中MyD88和TRIF的表达均明显高于正常皮肤组织,差异均有统计学意义(均P<0.05);MyD88和TRIF的表达差异均无统计学意义(均P>0.05)。显微镜下可见:Pearson相关性分析显示MyD88和TRIF的表达均无相关性(r分别为-0.114和0.185,P分别为0.632和0.436)。结论 MyD88和TRIF通过不同信号通路在MPD和EMPD的发生发展中发挥重要作用。

黄芩总黄酮改善哮喘模型小鼠气道炎症及对TLR3/TRIF通路表达的影响

目的探讨黄芩总黄酮对哮喘小鼠气道炎症的改善作用及对Toll样受体3(Toll-likereceptor3,TLR3)/β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TIRdomain-containing adaptorinducing interferon-beta,TRIF)通路表达的影响。方法随机将50只4~6周龄雌性Balb/c小鼠分为正常对照组、模型组、阳性对照组(地塞米松,1mg/kg)、黄芩总黄酮低剂量组(25mg/kg)、黄芩总黄酮高剂量组(50mg/kg),每组各10只小鼠。除正常对照组外,其余各组构建支气管哮喘(以下简称为哮喘)小鼠模型。苏木精-伊红(hematoxylin-eosinstaining,HE)染色法观察小鼠肺组织病理改变,并根据病理图片分析小鼠气道重塑情况,计算支气管壁面积/内周长(W/Pi)、支气管平滑肌面积/内周长(S/Pi)和平滑肌细胞核数/内周长(N/Pi)值。采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorben tassay,ELISA)法检测肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavagefluid,BALF)中白细胞介素6(interleukin6,IL-6)和IL-8水平。实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-timepolymerase chain reaction,qPCR)检测小鼠肺组织中TLR3、TRIFmRNA表达水平。Westernbolt检测小鼠肺组织中TLR3、TRIF蛋白表达水平。结果病理结果显示,正常对照组的支气管腔和肺泡均保持良好的完整性;模型组的小鼠表现出黏膜水肿、炎性细胞浸润(黏膜下层和黏膜层)以及气道壁炎性细胞浸润数量增加,给予黄芩总黄酮后小鼠支气管腔和肺泡炎性细胞浸润减少,且黄芩总黄酮高剂量组炎性细胞数少于黄芩总黄酮低剂量组。与正常对照组相比,模型组W/Pi、S/Pi、N/Pi,IL-6、IL-8,TLR3、TRIFmRNA和蛋白水平,均显著增加(P均<0.05);与模型组相比,黄芩总黄酮低、高剂量组和阳性对照组W/Pi、S/Pi、N/Pi,IL-6、IL-8,TLR3、TRIFmRNA和蛋白水平,均显著降低(P均<0.05);黄芩总黄酮低剂量组W/Pi、S/Pi、N/Pi,IL-6、IL-8,TLR3、TRIFmRNA和蛋白水平,均显著高于黄芩总黄酮高剂量组(P均<0.05);黄芩总黄酮高剂量组与阳性对照组各指标比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论黄芩总黄酮可有效改善哮喘模型小鼠的气道炎症,其机制可能与抑制TLR3/TRIF信号通路,降低炎症反应,缓解气道重塑有关。

由不同接头分子介导的Toll样受体信号通路

Toll样受体(Toll-likereceptors,TLRs)是一类重要的模式识别受体(patternrecognitionreceptors,PRR)。Toll样受体信号通路既激活先天性免疫又对获得性免疫应答的启动发挥重要作用。一类包含TIR结构域的接头分子如MyD88、TIRAP、TRIF、TRAM可募集到不同Toll样受体的TLR胞质区,转导特异的信号通路。依据信号通路中接头分子的不同,Toll样受体信号通路一般分为MyD88依赖型信号通路和MyD88非依赖型/TRIF依赖型信号通路。

Toll样受体信号传导通路的研究进展

Toll样受体(toll like receptors,TLRs)能识别病原微生物相关分子模式,募集含有Toll/白介素-1受体(TIR)结构域的接头蛋白分子,通过髓样分化蛋白88(MyD88)依赖性信号传导通路或由β-干扰素TIR结构域衔接蛋白(TRIF)依赖性信号传导通路启动信号传导,继而引发特异性的免疫应答。作者就TLRs的结构特征、分布、配体识别、参与信号传导的接头蛋白分子及介导的信号传导通路的最新研究进展进行综述。

中华鳖MyD88部分序列克隆及其在组织中的表达差异分析

MyD88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)是多数TLRs(Toll like receptor,TLRs)信号转导过程中的关键接头分子。研究根据MyD88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)TIR结构域(Toll-like/IL-1 receptor domain)保守区设计简并引物,通过PCR扩增,成功地从中华鳖脾脏cDNA中扩增出351bp的目标序列。测序后经结构域和序列比较分析,扩增片段为中华鳖的MyD88 TIR结构域。该序列与大黄鱼、鸡等脊椎动物的MyD88的TIR结构域序列同源性和相似性分别为72.9%～86%和77.6%～83.6%。以热灭活嗜水气单胞菌刺激中华鳖后,经荧光定量PCR检测,在48h内,肝、脾和肾组织中MyD88 mRNA相对表达量均出现不同程度的增加,尤以脾脏中的增幅最为明显,为对照组的6.89倍;中华鳖心脏成纤维样细胞经20ng LPS刺激后1～8h,MyD88表达量有所提高,24h的表达量最高。该研究结果将为开展中华鳖天然免疫奠定良好基础。

TLR信号通路研究进展

TLR在识别病原体相关分子中起到关键作用,提示其与免疫炎症相关。TLR在天然免疫反应中不仅可以清除病原体,而且可通过识别病原体相关分子过程中有效建立获得性免疫体系。在TLR介导的细胞信号通路中,接头分子TLR/IL-1R结构域对免疫炎症反应起到了重要的作用,它可产生一些前炎症细胞因子如NO、1型干扰素等,并上调共刺激分子表达。现就TLR与其相关配体作用关系及TLR介导的天然免疫激活进行综述。

针刺负调控TLR4/TRIF信号通路关键因子对脑出血大鼠炎性反应表达的影响

目的探讨针刺“百会”透“曲鬓”穴对急性脑出血大鼠TLR4/TRIF信号通路关键因子Toll样受体4(TLR4)、TRIF(TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-βTRIF)、TRAM(TRIF-related Adaptor Molecule,TRAM)、NF-κB(核因子κB)表达的影响。方法将72只Wistar雄性大鼠随机分为假手术组、模型组、针刺+模型组(简称针刺组)、TAK242组,每组按1 d、3 d、7 d时间节点分为3个亚组,每组6只。自体血注入法建立脑出血大鼠模型。采用针刺“百会”透“曲鬓”穴干预,Longa评分法对脑出血后大鼠神经功能进行评估;Western-blot法检测血肿组织TLR-4、TRIF、TRAM、NF-κB蛋白表达。结果神经行为学:与模型组比较,针刺组于3 d、7 d时间节点大鼠神经功能评分差异显著(P<0.05);TAK242组于3 d、7 d时间节点大鼠神经功能评分差异显著(P<0.01);与针刺组比较,TAK242组于3 d时间节点大鼠神经功能评分差异显著(P<0.05)。Western-blot结果:针刺组、TAK242组各时间节点TLR-4、TRIF、TRAM、NF-κB蛋白表达水平均显著低于模型组(P<0.01);TAK242组各时间节点TLR-4、TRIF、TRAM、NF-κB蛋白表达水平均显著低于针刺组(P<0.01)。结论针刺可能通过负调控TLR4/TRIF信号通路中TLR-4、TRIF、TRAM、NF-κB蛋白的表达,减轻脑出血后炎性损伤,改善大鼠神经功能缺损症状,发挥脑保护作用。

白藜芦醇抑制软骨肉瘤细胞SW1353炎症反应的实验研究

目的:探讨白藜芦醇(RES)对白细胞介素1β(IL-1β)处理的人软骨肉瘤细胞SW1353的效应及其可能机制。方法:采用CCK-8法测定不同浓度IL-1β及RES对SW1353细胞增殖活力的影响。ELISA法检测细胞培养基上清基质金属蛋白酶13(MMP-13)的水平。RT-PCR法检测Toll样受体4(TLR4)、TIR结构域接头分子(TRIF)、髓样分化蛋白88(My D88)mRNA表达。结果:IL-1β处理对SW1353细胞的增殖活力无明显抑制作用(P>0.05)。RES浓度为6.25、12.5μmol·L^(-1)时能促进细胞增殖(P<0.05)。RES浓度在50μmol·L^(-1)时对细胞增殖无明显作用(P>0.05),而RES浓度为200μmol·L^(-1)时则显著抑制细胞增殖(P<0.05)。IL-1β和RES联合处理与单纯RES处理比较,能够降低细胞增殖活力(P<0.05)。相比对照组,IL-1β处理组培养基上清中MMP-13分泌水平及TLR4、TRIF、My D88 mRNA表达均明显增加(P<0.01),而RES则能够显著抑制IL-1β诱导的MMP-13的分泌水平,并降低TLR4、TRIF、My D88 mRNA的表达(P<0.01)。结论:RES可以通过抑制TLR4信号通路对体外培养的SW1353细胞发挥抗骨性关节炎效应。

Toll样受体4接头分子对乳酸诱导巨噬细胞M2极化的促进作用及其机制

目的:探讨Toll样受体4 (TLR4)接头分子髓样分化因子88 (MyD88)和诱导β干扰素的Toll/白细胞介素1 (IL)受体(TIR)结构域衔接蛋白(TRIF)基因敲除后对乳酸诱导巨噬细胞极化的促进作用,初步阐明乳酸免疫调控的可能机制。方法:体外培养小鼠巨噬细胞Raw264.7,采用慢病毒法构建CRISPR/Cas9基因编辑载体,定向敲除MyD88和TRIF基因(MyD88-KO组和TRIF-KO组),设未感染的Raw264.7细胞为对照组,实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法和Western blotting法检测基因敲除效果。实验分为未处理Raw264.7细胞组、Raw264.7+乳酸组、MyD88-KO组、MyD88-KO+乳酸组、TRIF-KO组和TRIF-KO+乳酸组。15 mmol·L^(-1)乳酸诱导24 h后进行各指标检测。RT-qPCR法检测各组细胞中M2极化表型分子巨噬细胞甘露糖受体CD206和精氨酸酶1(Arg1) mRNA表达水平,光学显微镜下观察各组细胞形态表现,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测各组细胞上清中肿瘤坏死因子α (TNF-α)、γ干扰素(INF-γ)和白细胞介素10 (IL0)水平,Western blotting法检测各组细胞中核因子κB (NF-κB)信号通路相关蛋白表达水平。采用Autodock软件将乳酸分别与TLR4、MyD88和TRIF分子对接并观察其结合情况。结果:采用CRISPR/Cas9技术进行基因定向敲除后,与对照组比较,MyD88-KO组和TRIF-KO组细胞中MyD88和TRIF mRNA及蛋白表达水平明显降低(P<0.05或P<0.01)。乳酸作用24 h后,与未处理Raw264.7细胞组比较,Raw264.7+乳酸组细胞中M2极化标志物CD206和Arg1 mRNA表达水平明显升高(P<0.05);与MyD88-KO组比较,MyD88-KO+乳酸组细胞中CD206和Arg1 mRNA表达水平均升高(P<0.05);与TRIF-KO组比较,TRIF-KO+乳酸组细胞中CD206和Arg1 mRNA表达水平均降低(P<0.05)。细胞形态表现,Raw264.7+乳酸组细胞表现出M2极化形态,即体积增大、明显突起伪足和偏锥形细胞比例增加;MyD88-KO+乳酸组细胞同样表现出M2极化形态变化;TRIF-KO+乳酸组细胞形态变化不明显。ELISA法检测,与未处理Raw264.7细胞组比较,Raw264.7+乳酸组细胞中TNF-α水平明显降低(P<0.05),INF-γ和IL0水平差异无统计学意义(P>0.05);与MyD88-KO组比较,MyD88-KO+乳酸组细胞中TNF-α水平明显降低(P<0.05),INF-γ水平差异无统计学意义(P>0.05),IL0水平明显升高(P<0.05);与TRIF-KO组比较,TRIF-KO+乳酸组细胞中TNF-α水平明显升高(P<0.05),INF-γ和IL0水平差异无统计学意义(P>0.05)。Western blotting法检测,与未处理Raw264.7组比较,Raw264.7+乳酸组、MyD88-KO组、MyD88-KO+乳酸组、TRIF-KO组和TRIF-KO+乳酸组细胞中TLR4蛋白表达水平差异均无统计学意义(P>0.05),Raw264.7+乳酸组细胞中核因子κB抑制蛋白α (IκB-α)和p65蛋白表达水平明显降低(P<0.05);与MyD88-KO组比较,MyD88-KO+乳酸组细胞中IκB-α和p65蛋白表达水平明显降低(P<0.05);与TRIF-KO组比较,TRIF-KO+乳酸组细胞中IκB-α和p65蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。分子对接,乳酸分别与TLR4、MyD88和TRIF形成氢键数为2、4和4,结合能分别为-2.72、-3.24和-3.66。结结论论:乳酸作用巨噬细胞后,可通过调控TRIF抑制IκB-α活性进而抑制NF-κB,促进M2极化。