猪伪狂犬病病毒变异株gE/gI/TK三基因缺失突变株的构建及纯化

根据GenBank中公布的猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)UL区基因序列(KJ789182)设计2对特异性引物,扩增PRV NY株TK基因两侧序列,克隆至pUC-19载体,然后绿色荧光蛋白标记基因,构建转移质粒pUCTKLRE。用转移质粒pUC-TKLRE和PRV双基因缺失突变株rPRV NY-gE-/gI-DNA共转染ST细胞,通过蚀斑纯化,获得表达荧光蛋白的PRV三基因缺失突变株rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+。经PCR鉴定及测序,证实获得的三基因缺失株rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+在TK基因上缺失了311bp。该病毒与亲本株PRV NY在ST细胞上培养时,具有相似的生长曲线,但其体外生长动力学比亲本株弱;且对非靶标动物小鼠是安全的。结果表明,本试验釆用同源重组,同时结合蚀斑克隆纯化技术,成功构建了1株以目前PRV流行变异株为亲本株的gE/gI/TK三基因缺失病毒,为防控当前PRV变异毒株的疫情、根除PR提供技术支持。

猪伪狂犬病病毒变异株TK/gE/gI三基因缺失突变株在小鼠体内的免疫原性

应用PCR方法扩增了猪伪狂犬病病毒(PRV)NY株TK基因两侧序列,克隆至pUC-19载体,同时插入绿色荧光蛋白标记基因,构建转移质粒pUC-TKLRE,并与PRV变异株gE/gI双基因缺失突变株rPRV NY-gE-/gI-的基因组DNA共转染ST细胞,通过蚀斑纯化,获得表达荧光蛋白的PRV三基因缺失突变株。分别用PRV三基因缺失突变株、rPRV NY-gE-/gI-、PRV商品活疫苗Bartha-K61株、DMEM细胞培养液免疫6周龄雌性小鼠,2周后对小鼠进行第2次免疫,且首免后6周用PRV强毒NY株对小鼠进行攻毒试验。结果显示,成功拯救PRV三基因缺失突变株rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+,且对小鼠是安全的。间接ELISA试验和病毒中和试验证实rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+使小鼠机体产生了较高滴度的PRV特异性抗体,小鼠外周血T淋巴细胞亚群的测定证明,其诱导小鼠机体产生了细胞免疫应答。攻毒试验结果显示,rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+对PRV强毒NY株的攻击具有一定的抵抗力。本试验获得的PRV三基因缺失病毒rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+有望成为一种防控当前PR流行的疫苗株。