伪狂犬病病毒胸苷激酶基因缺失株的构建和应用研究进展

伪狂犬病病毒(PRV)也称猪疱疹病毒I型,传染性延髓麻痹病病毒或奇痒症病毒,是引起多种家畜和野生动物以发热、流产和死产、奇痒(猪除外)及脑脊髓炎为主要症状的一种α-疱疹病毒。1902年,匈牙利学者Aujeszky首先报道了伪狂犬病,目前该病已在全世界广泛传播。猪是该病毒的主要宿主和带毒者,因而对该病的传播起着重要作用。近年来,该病的流行有扩大趋势,成为各国当前密切注视的传染病之一。

应用荧光定量PCR方法检测伪狂犬病病毒弱毒株在猪体组织中的分布

为了解伪狂犬病病毒(PRV)TK/PK/gE三基因缺失弱毒株在猪体组织中的分布情况,针对PRV gB基因保守区设计并合成1对特异性引物,建立并优化了一种可快速、定量检测PRV的SYBR-GreenⅠ荧光定量PCR方法。该检测方法特异性强且敏感度高,最低检测浓度为10^(1)拷贝/μL。PRV TK/PK/gE三基因缺失弱毒株免疫仔猪后可少量存在于大脑、小脑、肝脏、脾脏、肺脏、扁桃体和颌下淋巴结中,部分仔猪鼻甲骨病毒含量较高。应用本研究建立的荧光定量PCR方法阳性检出率为79.2%,而常规PCR方法阳性检出率仅为45.8%。结果表明,本研究建立的荧光定量PCR方法为了解弱毒株在猪体的分布提供了快速、敏感的检测手段。PRV TK/PK/gE三基因缺失弱毒株在猪组织中的分布情况为进一步揭示其组织嗜性、安全性和免疫机制提供了数据。

PRV △gE/TK/US3基因缺失株的构建及对小鼠的免疫效力

为验证伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)US3基因缺失后作为疫苗的免疫效力,构建PRV△gE/TK/US3基因缺失株。利用PRV QYY2012变异株基因组扩增US3基因两侧序列作为同源重组的左右侧同源臂,以绿色荧光蛋白(EGFP)为标记基因,经酶切依次连接至pBluescript SK(-),构建重组转移载体pSK-US3-LR-EGFP。将pSK-US3-LR-EGFP和PRV△gE/TK株基因组共转染293 T细胞,以绿色荧光为标记经蚀斑纯化获得重组病毒PRV△gE/TK/US3/EGFP~+株。将pcGlobin2-Cre质粒和PRV△gE/TK/US3/EGFP~+株基因组共转染293 T细胞,利用Cre-Loxp系统去除EGFP基因,蚀斑纯化无荧光重组病毒,获得PRV△gE/TK/US3基因缺失株,并对该毒株遗传稳定性、生物学特性、安全性和免疫效力进行初步研究。PCR及测序鉴定证实PRV△gE/TK/US3株缺失US3基因925 bp,在Vero细胞可稳定传代;与PRV△gE/TK亲本株相比,PRV△gE/TK/US3株病毒滴度较低,但仍具有良好的增殖能力。该基因缺失毒株接种小鼠后具有安全性,能产生较PRV△gE/TK株更高水平的抗PRV中和抗体,且能维持较长时间;PRV△gE/TK/US3株免疫小鼠对PRV强毒株攻击可提供完全保护力。结果表明,成功构建的PRV△gE/TK/US3基因缺失株具有良好的免疫原性,可作为优秀的伪狂犬病基因缺失疫苗候选种毒株。

猪伪狂犬病病毒变异株TK/gE/gI三基因缺失突变株在小鼠体内的免疫原性

应用PCR方法扩增了猪伪狂犬病病毒(PRV)NY株TK基因两侧序列,克隆至pUC-19载体,同时插入绿色荧光蛋白标记基因,构建转移质粒pUC-TKLRE,并与PRV变异株gE/gI双基因缺失突变株rPRV NY-gE-/gI-的基因组DNA共转染ST细胞,通过蚀斑纯化,获得表达荧光蛋白的PRV三基因缺失突变株。分别用PRV三基因缺失突变株、rPRV NY-gE-/gI-、PRV商品活疫苗Bartha-K61株、DMEM细胞培养液免疫6周龄雌性小鼠,2周后对小鼠进行第2次免疫,且首免后6周用PRV强毒NY株对小鼠进行攻毒试验。结果显示,成功拯救PRV三基因缺失突变株rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+,且对小鼠是安全的。间接ELISA试验和病毒中和试验证实rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+使小鼠机体产生了较高滴度的PRV特异性抗体,小鼠外周血T淋巴细胞亚群的测定证明,其诱导小鼠机体产生了细胞免疫应答。攻毒试验结果显示,rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+对PRV强毒NY株的攻击具有一定的抵抗力。本试验获得的PRV三基因缺失病毒rPRV NY-gE-/gI-/TK--EGFP+有望成为一种防控当前PR流行的疫苗株。