HIV感染儿童抗病毒治疗后外周血单个核细胞的TK2表达水平及意义

目的探讨艾滋病病毒(HIV)感染儿童抗病毒治疗后外周血单个核细胞(PBMC)中潜在线粒体毒性标志物表达水平及其相关机制。方法选择60例抗病毒治疗的HIV感染儿童和20例健康儿童,检测PBMC中胸苷激酶2(TK2)基因的mRNA和蛋白质表达水平变化,与治疗方案及治疗时间的相关性分析。结果 HIV感染患儿抗病毒治疗的PBMC中TK2基因mRNA和蛋白质表达水平显著高于对照组儿童(mRNA:2.45/1,蛋白质:3.2/1)差异均有统计学意义(P<0.05)。随着治疗时程的增加,司他夫定治疗组较齐多夫定治疗组的TK2蛋白质水平增加更显著(P<0.05)。将患儿分别按基线CD4+T淋巴细胞计数、基线病毒载量、性别、年龄以及HIV传播途径进行分组比较,各组患儿间TK2水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论外周血PBMC的TK2水平可反映儿童抗病毒治疗后的线粒体毒性,有望成为线粒体毒性检测指标。

临床症状轻微的TK2相关的线粒体DNA耗竭综合征1例

线粒体DNA耗竭综合征(mitochondrial DNA depletion syndromes,MDS)是由核基因突变引起线粒体DNA合成或复制障碍的一类常染色体隐性遗传病,是儿童常见的呼吸链缺陷病,可导致新生儿和婴儿早期死亡。目前研究发现可分为4型:肌病型、脑肌病型、肝脑病型、神经胃肠病型。其中肌病型致病基因是TK2基因和SLC25A4基因。TK2基因变异有多种临床表型,包括婴儿型、儿童型及晚发型。本文首先在国内报道1例TK2基因变异致临床症状轻微的MDS病型患儿的临床资料,并进行文献复习,以期提高临床医生对TK2基因变异所致的肌病型MDS临床及基因诊断的认识。

TK2相关线粒体DNA耗竭综合征2例并文献复习

目的探讨TK2相关线粒体DNA耗竭综合征的临床和病理特征、诊断及预后，提高对该病的认识。方法报道2例基因和病理检查确诊的TK2相关肌病型线粒体DNA耗竭综合征患者，并对既往报道的58例病例进行文献复习。结果结合文献报道的58例及本次报道的2例共60例，其中男35例，女25例，起病年龄从出生至74岁，3岁以内发病者54例。患者均存在不同程度肢体无力，包括本研究2例在内的40例表现为单纯肌病，余20例伴其他系统受累。53例血清肌酸激酶升高（211～6500IU／L），24例血清乳酸增高（2．3～12．0mmol／L）。接受肌肉病理检查的55例患者中48例（87％）可见破碎红纤维和／或细胞色素C氧化酶阴性肌纤维，其中接受超微病理检测的11例患者中9例可见线粒体异常。接受肌肉组织呼吸链酶活性检测的33例患者中31例存在酶活性减低。接受肌肉组织线粒体DNA拷贝数检测的41例患者中36例DNA拷贝数显著减少，为健康对照的4％～25％。60例患者中共检测到42种TK2突变，包括本研究2例患者中新发现的TK2C．923A〉G和c．619—2A〉T突变。结论TK2相关线粒体DNA耗竭综合征最常见的临床表型为婴幼儿期起病的严重进展性肌病，肌肉活检线粒体病特征性病理改变阳性率高，具有重要诊断价值。

涡动相关通量计算及三种主要软件的比较分析

涡动相关方法是当前地气交换研究中最基本的通量观测方法。依据有关观测数据计算所得的通量结果与湍流资料处理软件的配置关系很大。本文选择了国际上通用的三种主要涡动相关数据处理软件(即EdiRe、TK2/TK3和EddyPro),对国内外5个不同下垫面的通量站资料进行了比较分析。依据EdiRe计算模块逐步完善的EdiRe-w程序的处理结果与其他两个软件的比较表现出较好的一致性:(1)三个软件处理结果的相关性很高,各决定系数R2多数大于0.99;(2)所得风速、温度、水汽浓度和CO2浓度的平均值几乎完全一致;(3)动量通量(或摩擦速度u*)的比较,差别小于3%;感热、潜热和CO2通量的比较,EdiRe-w和EddyPro结果的差别一般小于5%;EdiRe-w和TK3的结果差异略大些,但即便对较难测量的潜热通量和CO2通量,相互差异也在9%以内。三个软件的比较结果表明,EdiRe软件具有模块功能较完备、搭配较灵活和运算速度明显较快的特点,是当前值得应用的好方法。

响应面法对Bacillus natto TK-2产聚-γ-谷氨酸(γ-PGA)发酵培养基的优化

通过Plackett-Burman设计和响应面分析对B.natto TK-2发酵产γ-PGA的培养基进行了优化。首先通过Plackett-Burman设计从6个因素中筛选出了有显著影响的葡萄糖、味精、CaCl_2等3个因素;然后通过最陡爬坡和Box-Behnken设计进一步优化,并利用SAS软件进行回归分析,得到以上3个因素的最佳浓度分别为(g/ L):葡萄糖21.4,味精25.1,CaCl_2 2.6。在优化后的培养基下,γ-PGA的产量比优化前提高了34.01%。

人乙酰肝素酶大亚基蛋白在大肠杆菌中的融合表达

目的:乙酰肝素酶在肿瘤转移、血管生成、组织发生等过程中起重要作用,其羧基端大亚基蛋白是该酶的重要组成部分,但由于此蛋白在体内含量少,易降解,很难直接从组织内得到一定数量的蛋白.本研究利用工程菌表达乙酰肝素酶的大亚基蛋白以期得到相当数量的蛋白,以便进一步用于该酶的抗体制备和功能研究.方法:从人胎盘cDNA文库中分离乙酰肝素酶蛋白全长编码基因,通过PCR和酶切等方法将乙酰肝素酶大亚基的基因克隆入原核表达载体pGEX-2TK中,测序鉴定序列完全正确后,转化大肠杆菌BL21(PlyS,DE3)进行表达.结果:工程菌BL21(PlyS,DE3,pGEX-2TK-50 ku HPA)成功表达出乙酰肝素酶大亚基融合蛋白.诱导1h后工程菌即开始表达大亚基融合蛋白,在诱导3 h后表达蛋白量达到最高,随着时间的延长,目的蛋白没有被降解.诱导剂IPTG的浓度对其表达量及其表达形式无显著影响.此蛋白的表达形式主要为包涵体形式.低温诱导可见少量可溶蛋白存在.结论:在大肠杆菌中成功表达了大亚基的融合蛋白.此蛋白可以用于进一步乙酰肝素酶的抗体制备、免疫鉴定、功能活性等研究.

湿热内蕴与脾肾阳虚型溃疡性结肠炎患者Th_1/Th_2的状态

目的研究湿热内蕴型和脾肾阳虚型溃疡性结肠炎患者白细胞介素2(IL-2)、IL-4、IL-10和干扰素γ(IFN-γ)的变化,以观察不同证型Th1/Th2的状态。方法收集20例溃疡性结肠炎患者(湿热内蕴型和脾肾阳虚型各10例),并与10例正常人对照,用放射免疫法测定患者血清中IL-2和IL-10的浓度,用酶联免疫吸附法(ELISA法)测定患者血清中IL-4和IFN-γ浓度,测定IL-2/IL-10比值和IFN-γ/IL-4比值。结果湿热内蕴组患者IL-2升高明显,其炎症反应属于IL-2诱导的Th1型免疫反应,而脾肾阳虚组患者IL-10升高明显,属于Th2型免疫反应。结论湿热内蕴型患者主要是以Th1型免疫反应为主,而脾肾阳虚型患者主要以Th2型免疫反应为主。

高效抗反转录病毒治疗中线粒体毒性指标检测的应用

目的：探讨 PBMC 线粒体毒性相关指标在监测艾滋病 HAART 过程中线粒体毒性的意义。方法选取线粒体 DNA（mtDNA）、线粒体胸苷激酶（TK2）和依赖 p53的核苷酸还原酶小亚基2（p53R2）为线粒体毒性检测指标，应用荧光定量实时 PCR 技术，观察22例接受以司他夫定（齐多夫定）＋拉米夫定为骨干 HAART 方案的艾滋病患者治疗前、治疗后48及96周 PBMC 中 mtDNA、TK2和p53R2表达水平的变化。组间比较采用独立样本 t 检验。结果艾滋病患者接受 HAART 前 PBMC 中mtDNA 相对表达量为3．27±0．94，治疗48及96周表达量分别为2．16±0．85和1．66±0．66，与治疗前比较差异均有统计学意义（t 值分别为－3．90和－6．29，均 P ＜0．01）；TK2相对表达水平治疗前为0．37±0．13，治疗48及96周分别为1．01±0．25及2．13±0．61，治疗前与治疗48、96周，以及治疗48周与96周比较，差异均有统计学意义（t 值分别为10．77、8．00和3．56，均 P ＜0．01）；p53R2水平治疗前为0．86±0．39，治疗48及96周分别为2．36±1．14和7．73±0．65，治疗前与治疗48、96周，以及治疗48周与96周比较，差异均有统计学意义（t 值分别为3．27、12．26和13．25，均 P ＜0．01）。结论艾滋病患者HAART 过程中 PBMC 线粒体毒性相关指标 mtDNA、TK2及 p53R2发生明显变化，可作为线粒体损害的监测指标。

pDR2/TK基因经大鼠肝血管途径导入后的研究

目的 探讨 pDR2 /TK基因经肝血管导入的方法。 方法 84只大鼠随机分为动脉TK、动脉TK +更昔洛韦 (GCV)、动脉对照、门静脉TK、门静脉TK +GCV、门静脉对照及空白对照等 7组。经肝左叶动脉或门静脉注射 pDR2 /TK基因或TE缓冲液 ,术后腹腔注射GCV或生理盐水 (NS)。用免疫组织化学及苏木素 伊红 (HE)染色的方法检测基因的表达及杀伤效应。结果 (1)动脉TK组及动脉TK +GCV组肝左叶表达阳性率 (4.86± 2 .13 ) %及 (4.3 4± 1.43 ) %显著高于右叶 (2 .0 4± 0 .91) %及 (2 .3 1± 0 .78) % (P <0 .0 1) ,经门静脉TK组肝左叶 (3 .2 7± 1.46) %亦明显高于右叶 (1.96± 0 .84) % (P <0 .0 5 ) ,但门静脉TK +GCV组左右叶间差异无显著性 (3 .17±1.5 6) %及 (2 .46± 1.10 ) % (P >0 .0 5 ) ;左叶表达阳性率经动脉途径明显高于经门静脉途径 (P <0 .0 5及 P <0 .0 1)。 (2 )肝左叶肝细胞坏死程度在动脉TK +GCV组高于门静脉TK +GCV组。结论 pDR2 /TK基因经肝左前叶动脉注射后在该肝叶内的表达效率。

pDR2/TK基因经肝动脉注射后杀伤效应的研究

目的 探讨 pDR2 /TK基因经大鼠肝左叶动脉注射后的靶向性表达及杀伤效应。 方法 将 48只大鼠随机分为 4组 ,分别给予 pDR2 /TK基因、更昔洛韦 ( ganciclovir ,GCV)、pDR2 /TK基因/生理盐水 (NS)、缓冲液 (TE) /GCV及TE/GCV。肝组织用原位杂交、免疫组织化学ABC法及苏木素 伊红 (HE)染色的方法检测基因转录、表达及杀伤效应。结果 pDR2 /TK基因在肝左叶有转录。单独注射pDR2 /TK基因组的肝左叶的表达率为 ( 4 .86± 2 .1 3) % ,明显高于肝右叶 [( 2 .0 4±0 .91 ) % ,(P <0 .0 1 ) ],未见明显的肝细胞坏死 ;注射 pDR2 /TK基因 +GCV组的肝左叶表达率为( 4 .34± 1 .43) % ,亦高于肝右叶 [( 2 .31± 0 .78) % ,(P <0 .0 1 ) ],肝左叶出现明显的大片状坏死 ,肝右叶坏死程度轻微 ;2组间的肝左叶或肝右叶表达率差异无显著性 (P >0 .0 5)。结论 pDR2