利用强启动子PermE^＊提高4＂-异戊酰基转移酶基因在变铅青链霉菌TK24中对螺旋霉素的4＂-异戊酰化水平

目的提高螺旋霉素生物转化为4"-异戊酰螺旋霉素的水平,为构建以4"-异戊酰螺旋霉素为主要组分的必特螺旋霉素新一代基因工程菌提供指导。方法构建重组质粒pKC1139-e-ist-ist和pKC1139-ist-ist,它们分别含有5'-上游插入红霉素抗性基因强启动子PermE*的4"-异戊酰基转移酶基因串连双拷贝,和4"-异戊酰基转移酶基因串连双拷贝;将它们分别导入到变铅青链霉菌TK24中,比较它们对螺旋霉素的4"-异戊酰化能力。结果在加入终浓度为50μg/mL螺旋霉素时,变铅青链霉菌TK24[pKC1139-e-ist-ist]比变铅青链霉菌TK24[pKC1139-ist-ist]对螺旋霉素的4"-异戊酰化水平提高近4倍。结论在变铅青链霉菌TK24中,PermE*可以增强4"-异戊酰基转移酶基因表达,明显提高对螺旋霉素的4"-异戊酰化水平。

柔红霉素C-14羟化酶基因在变铅青链霉菌TK24中的表达

将柔红霉素C-14羟化酶基因与酪氨酸酶基因启动子和红霉素抗性基因启动子串联连接,克隆到变铅青链霉菌TK24中进行表达。经过SDS-PAGE蛋白电泳、CO结合差光谱分析结果证明,重组克隆表达的羟化酶分子量约45 kD、重组的蛋白量约占细胞总蛋白的12％,并具有细胞色素P-450的特征。

棘白霉素脱酰酶基因工程菌的构建及应用研究

目的:以Streptomyces lividans TK24为表达宿主,构建高效表达棘白霉素脱酰酶(Ech DA)的基因工程菌。方法:从Actinoplanesutahensis NRRL 12052中获取Ech DA的基因片段,连接到链霉菌表达载体p NW-S1,采用诱导型启动子Plac与组成型启动子Perm E*和PSau3A,依次构建基因工程菌株ZNW-S11、ZNW-S12和ZNW-S13。通过分析启动子对Ech DA分泌表达的影响,确定工程菌的表达能力,随后完善发酵放大的工艺过程,将工程菌株发酵放大到300 L发酵罐水平。结果:成功实现了Ech DA在S.lividans TK24中的诱导分泌表达;在摇瓶水平,Ech DA的酶活可达到125U/L,在24h内可实现对15g/L米卡芬净前体FR901379的完全转化;在300L发酵罐水平,Ech DA的酶活可达到80U/L,可用于10g/LFR901379的完全转化。当前,国内在工业生产中仍使用原始菌A.utahensis来表达Ech DA,而开发的Ech DA基因工程菌,与之相比在生产效率上有了大幅度提升,有助于改良当前棘白霉素类抗生素的生产工艺。