桂枝汤含药血清对小鼠巨噬细胞Toll样受体3、4型及其下游信号转导通路元件的影响

目的:研究桂枝汤含药血清对LPS和Poly(I:C)刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7的Toll样受体(TLR)及其下游主要信号转导通路元件的影响,从mRNA和蛋白水平探讨桂枝汤含药血清防治感染性疾病的免疫学基础。方法:用LPS或Poly(I:C)分别刺激RAW264.7细胞,加桂枝汤含药血清干预24h后,取细胞上清液测定炎症因子TNF-α和IFN-β的含量;荧光定量PCR方法测定TLR3、TLR4和下游信号转导通路元件MyD88、TRAF-6、TRAM和TRIF mRNA的表达;Western blotting法分析TLR3、TLR4蛋白的表达;细胞免疫荧光法分析MyD88、TRAF-6蛋白表达的强弱。结果:桂枝汤含药血清可显著降低LPS刺激诱导的MyD88、TRAM和TRIF的高表达;Poly(I:C)刺激后,桂枝汤含药血清显著降低TLR3、MyD88和TRAM的高表达。结论:桂枝汤能直接作用于TLR3,抑制其高表达,阻断TLR3胞内信号转导的MyD88依赖和非依赖两条途径,抑制相关基因表达产物TNF-α、IFN-β过度分泌,具有TLR3拮抗剂样作用。桂枝汤也可直接作用于接头蛋白MyD88、TRAM和TRIF,影响TLR4信号转导的MyD88依赖和非依赖性途径,抑制TNF-α、IFN-β的过度分泌。

黄连解毒汤含药血清对Toll样受体34、型及其下游信号转导通路的影响

目的:研究黄连解毒汤含药血清对细菌脂多糖和双链RNA病毒核酸类似物聚肌胞刺激的小鼠巨噬细胞株RAW264.7 Toll样受体(TLR)及其下游主要信号转导通路的影响。方法:用脂多糖、聚肌胞分别刺激RAW264.7细胞,同时给予黄连解毒汤含药血清进行干预,24 h后,取细胞培养上清液,ELISA法测定炎症因子TNF-α和IFN-β的含量,荧光定量PCR方法测定TLR3、TLR4和下游信号转导通路髓样分化因子88(MyD88),肿瘤坏死因子受体相关因子-6(TRAF-6),TOLL样受体相关分子(TRAM)和TOLL样受体相关的干扰素活化子(TRIF)mRNA的表达,Western blotting法分析TLR3、TLR4蛋白的表达,同时用细胞免疫荧光法分析MyD88,TRAF-6蛋白表达的强弱,在mRNA水平和蛋白水平探讨黄连解毒汤对Toll样受体的作用机理。结果:黄连解毒汤含药血清显著降低LPS诱导的TLR4、MyD88、TRAF-6、TRAM和TRlF的高表达(与单纯LPS刺激组比较,P<0.05或P<0.01);Poly(I:C)刺激后,黄连解毒汤含药血清仅对TRAM利TRIF的表达有明显的降低作用(P<0.01)。结论:黄连解毒汤能阻断TLR4高表达,阻断TLR4胞内信号转导的MyD88依赖和非依赖两条途径(以阻断非依赖途径为主),抑制相关基因表达产物TNF-α、IFN-β过度分泌,具有TLR4拮抗剂样作用。黄连解毒汤也可直接作用于接头蛋白TRAM和TRIF,影响TLR3信号转录的MyD88非依赖性途径,抑制IFN-β的过度分泌。

TLRS信号转导通路与急性胰腺炎相关性研究进展

Toll样受体是生物进化过程中一种古老的天然免疫受体,是第一个能感知病原体而直接作出防御反应的天然免疫受体,并可以启动特异性免疫[1-2],被认为是目前哺乳动物唯一将细胞外抗原识别信息向细胞内传递,并引发针对该抗原系列免疫反应的关键跨膜蛋白[3].急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）主要是由于胰腺组织受到胰蛋白酶的自身消化作用,促进了胰腺的坏死和溶解.有研究表明肠道细菌和内毒素发生移居,是胰腺坏死组织继发细菌感染的重要原因,但在这一过程中Toll受体却起到了不可忽视的作用[5].现就TLRs（主要是TLR4）信号转导通路与AP相关性的研究进展简要综述如下.

TLR4/MyD88/NF-κB信号通路对甲基苯丙胺依赖CPP大鼠海马的影响

目的 研究TLR4/MyD88/NF-κB信号通路对甲基苯丙胺(methamphetamine,MA)依赖的条件性位置偏好(conditioned place preference,CPP)大鼠海马的影响,同时采用特异性抑制剂TAK-242抑制Toll样4受体(Toll-like receptor 4,TLR4),减轻MA依赖诱导的海马神经炎症。方法 建立MA(10 mg/kg,ip,14 d)依赖大鼠CPP模型,分别为生理盐水组、MA组、TAK-242组、MA+TAK-242组。TAK-242组和MA+TAK-242组先分别腹腔注射抑制剂TAK-242(3 mg/kg),1h后MA+TAK-242组再腹腔注射MA(10 mg/kg)。采用Western Blot实验和采用荧光定量PCR实验检测MA依赖CPP大鼠海马中TLR4、MyD88、TRAF6、IκB-α、p-IκB-α、NF-κBp65、p-NF-κBp65蛋白的表达和mRNA表达。结果 与生理盐水组相比,MA组TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κBp65的蛋白和mRNA表达均升高(P <0.001或P <0.01),IκB-α的蛋白和mRNA表达下降(P <0.01),p-IκB-α、p-NF-κBp65的表达升高(P <0.01或P <0.05);与MA组相比,MA+TAK-242组TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κBp65的蛋白和mRNA表达均下降(P <0.001、P<0.01或P <0.05),IκB-α的蛋白和mRNA表达升高(P <0.01),p-IκB-α、p-NF-κBp65表达下降(P <0.01或P <0.05)。结论 MA依赖可通过激活TLR4/MyD88/NF-κB信号通路,诱导CPP大鼠海马神经炎症的发生,采用特异性TLR4抑制剂可以减轻MA诱导的神经炎症。

不同剂量天麻素对甲基苯丙胺依赖CPP大鼠海马中TLR4/MyD88/NF-κB炎症信号通路的影响

目的探讨不同剂量的天麻素(Gastrodin,Gas)对甲基苯丙胺(Methamphetamine,Meth)依赖条件性位置偏爱(Conditioned place preference,CPP)大鼠海马中TLR4/MyD88/NF-κB通路的作用。方法建立Meth(10 mg/kg,ip,14 d)依赖大鼠CPP模型,采用低中高剂量的天麻素(10、30、100 mg/kg)干预14 d后,采用Western blotting和RT-qPCR方法检测TLR4/MyD88/NF-κB信号通路中关键因子的蛋白和mRNA在海马中的表达水平。结果天麻素干预后TLR4、MyD88、NF-κB p65、TRAF6的蛋白和mRNA表达呈剂量依赖性降低(P<0.001、P<0.01或P<0.05)、p-NF-κB p65的蛋白表达呈剂量依赖性降低(P<0.01或P<0.05)、IκB-α的蛋白和mRNA表达呈剂量依赖性升高(P<0.01或P<0.05),天麻素干预后p-IκB-α的蛋白表达降低(P<0.01)。结论天麻素干预对甲基苯丙胺依赖CPP大鼠海马的神经炎症具有保护作用,且与TLR4/MyD88/NF-κB信号通路密切相关。

补阳还五汤抑制TLR4信号通路减轻db/db糖尿病小鼠周围神经病变炎症反应

目的观察补阳还五汤对db/db糖尿病小鼠周围神经病变炎症反应中TLR4/MAPK/NF-κB信号通路以及炎症因子的作用,探讨其对周围神经小鼠炎症损伤的保护机制。方法将50只db/db小鼠随机分成5组:空白对照组、模型组、补阳还五汤低、中、高剂量组[1.6,3.2,6.4 g/(kg·d)],每组10只。空白对照和模型组以10 ml/kg体质量的去离子水灌胃,各给药组小鼠均以10 ml/kg体质量相应浓度的药物灌胃,每日1次,连续84 d。第84天最后一次给药后,检测小鼠足底热敏反应时间,采用ELISA法检测小鼠血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)及IL-1β的表达水平,采用Western blot法检测小鼠背根神经节中TLR4、p38 MAPK、p-P38、IκB-α、P65、p-IκB-α和p-P65的表达量。结果与空白对照组相比,模型组小鼠足底热敏反应时间显著增加(P<0.05),其血清中IL-6、IL-1β和TNF-α及背根神经节中TLR4、p-P38、p-IκB-α和p-P65蛋白的表达水平也显著增强,差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组对比,各给药组能显著缩短小鼠足底热敏反应时间(P<0.05);血清中IL-6、IL-1β和TNF-α及背根神经节中TLR4、p-P38、p-IκB-α和p-P65表达水平下调(P<0.05)。随着剂量的增加,db/db小鼠热敏反应时间及相关炎性因子的表达水平相应降低,其中以高剂量组db/db小鼠减少较为显著。结论补阳还五汤可通过抑制TLR4、p38 MAPK及NF-κB信号转导通路的异常激活,缓解db/db糖尿病小鼠周围神经病变的炎症反应,从而保护周围神经的功能。

金欣口服液对呼吸道合胞病毒感染的小鼠肺泡巨噬细胞TLR7信号转导通路的影响

目的:研究金欣口服液含药血清对呼吸道合胞病毒(RSV)感染的小鼠肺泡巨噬细胞(RAW264.7)Toll样受体7(TLR7)信号转导通路的影响,探讨其可能的抗病毒机制。方法:RSV感染培养的RAW264.7细胞,用金欣口服液含药血清进行干预,24h后收集细胞及上清液,Western Blot法检测RAW264.7细胞TLR7、髓样分化因子-88(MyD88)、核因子(NF-κB)、干扰素调节因子7(IRF7)蛋白表达,ELISA法检测细胞上清液肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-α(IFN-α)的含量。结果:金欣口服液含药血清能降低RSV感染24h后TLR7、MyD88、NF-κB蛋白表达水平(P<0.01,P<0.05),而对IRF7的表达无明显的影响;下调细胞上清液中的TNF-α表达(P<0.01),IFN-α未能测出。结论:金欣口服液含药血清可能通过抑制TLR7/MyD88/NF-κB/TNF-α通路发挥抗RSV作用。

经筋微创松解术治疗膝骨关节炎对TLR4/MyD88/NF-κB信号转导通路的影响

目的:探讨经筋微创松解技术治疗膝骨关节炎的作用机制。方法:选取24只清洁级健康6月龄新西兰兔,6只为空白组,其余18只统一采用1.6%木瓜蛋白酶造模,空白组予以等剂量0.9%氯化钠溶液膝关节腔内注射;6周后,将18只新西兰兔等分为3组,分别为经筋微创组、电针组、造模组,治疗4周。光镜观察各组兔软骨HE染色病理切片结果;荧光定量PCR和Western blot分别检测各组软骨TLR4、MyD88、NF-κB基因和蛋白表达变化。结果:造模组膝关节软骨表面粗糙,软骨层厚薄不均;经筋微创组膝关节软骨表面轻度破坏;电针组膝关节软骨表面欠光滑,表层轻度破坏。与造模组比较,空白组、电针组、经筋微创组软骨TLR4、MyD88、NF-κB mRNA及蛋白表达均显著下调(P﹤0.05);与电针组比较,经筋微创组(除MyD88)mRNA及蛋白表达均显著下调(P﹤0.05)。结论:经筋微创松解疗法可能通过调控TLR4信号转导通路,抑制下游MyD88、NF-κB表达,阻断炎性细胞因子的分泌,改善关节疼痛、活动功能障碍等症状。

金欣口服液含药血清对RSV感染RAW264.7细胞TLR3信号转导通路的影响

目的探讨金欣口服液对呼吸道合胞病毒(RSV)感染的信号转导通路影响及其可能作用机制。方法分别以金欣口服液76.8g/(kg·d)、利巴韦林颗粒128.1mg/(kg·d)予大鼠灌胃3天,制备金欣口服液、利巴韦林颗粒含药血清。RSV感染RAW264.7细胞分为模型组、利巴韦林组与金欣组。利巴韦林组与金欣组分别给予利巴韦林与金欣口服液含药血清2.5ml进行干预。另设正常细胞作为正常组。正常组与模型组加入2%FBS维持液2.5ml。12h后收集细胞,检测RAW264.7细胞Toll样受体3(TLR3)、TANK结合激酶1(TBKl)和干扰素调节因子3(IRF3)mRNA及其蛋白表达。结果 RSV感染RAW264.7细胞12 h后可诱导TLR3、TBK1和IRF3 mRNA及其蛋白的高表达(P<0.01),金欣口服液含药血清及利巴韦林均可下调TLR3、TBK1和IRF3 mRNA及其蛋白的高表达(P<0.01),其中金欣口服液对TLR3蛋白的下调作用优于利巴韦林(P<0.05)。结论 RSV能够诱导TLR3信号转导通路的激活,上调TBK1和IRF3的表达,而金欣口服液含药血清能够抑制TLR3信号转导通路,从而起到抗RSV的作用。

TLR4/TRIF信号转导通路与支气管哮喘的关系研究进展

支气管哮喘(简称哮喘)的发病机制与免疫失衡有关,而Toll样受体连接天然免疫和获得性免疫,其中TLR4与哮喘发病密切相关。本文从TRL4/TRIF信号转导通路各信号分子的生物学特征、功能、调节及特异性拮抗进行综述。TLR4/TRIF通路的研究可能在将来的哮喘病理机制和药物治疗方面起到重要的作用。

经筋微创松解疗法联合嘎日迪-15味丸对膝骨性关节炎患者TLR4/MyD88/NF-κB信号转导通路及TGF-β_1水平的影响

目的:探讨经筋微创松解疗法联合嘎日迪-15味丸对膝骨性关节炎(KOA)患者TLR4/MyD88/NF-κB信号转导通路及转化生长因子β_1(TGF-β)1水平的影响。方法:将KOA患者98例(98膝)随机分为2组各49例,对照组给予嘎日迪-15味丸治疗,实验组在对照组基础上给予经筋微创松解疗法,疗程均为2个月;观察2组治疗效果,比较2组治疗前后膝关节WOMAC评分、关节液中前列腺素E_2(PGE)2、基质金属蛋白酶-9 (MMP-9)、TGF-β_1水平、关节软骨中Toll样受体4 (TLR4)、髓样分化因子(MyD88)、核因子κB (NF-κB)蛋白表达。结果:总有效率实验组为89.90%,对照组为71.43%,2组比较,差异有统计学意义(P <0.05)。治疗后2组功能、关节疼痛、僵硬等评分均较治疗前降低(P <0.05),且实验组各项评分均低于对照组(P <0.05)。治疗后2组关节积液TGF-β_1、PGE_2、MMP-9水平均较治疗前降低(P <0.05),且实验组各项指标水平均低于对照组(P <0.05)。治疗后2组关节软骨MyD88、TLR4、NF-κB蛋白表达水平较治疗前降低,且实验组各项指标水平均低于对照组(P <0.05)。结论:经筋微创松解疗法联合嘎日迪-15味丸治疗KOA疗效显著,其作用机制可能与降低MyD88、TLR4、NF-κB蛋白表达及TGF-β_1、PGE_2、MMP-9水平有关。

苦参碱治疗慢性萎缩性胃炎的实验研究

目的:探讨苦参碱对大鼠慢性萎缩性胃炎(CAG)的影响及其作用机制。方法:采用多因素复合法建立CAG模型,将大鼠分为正常组、模型组、阳性对照组(维酶素300 mg·kg^(-1))、苦参碱高剂量组(200 mg·kg^(-1))、苦参碱低剂量组(100 mg·kg^(-1)),每组10只。灌胃给药,连续治疗8周后,于光镜下观察胃黏膜组织病理学并进行病理程度分级;放射免疫法测定血清胃泌素(GAS)和血浆生长抑素(SS)含量;酶联免疫吸附法测定胃黏膜匀浆液中白细胞介素Iβ(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)浓度,实时定量聚合酶链反应法测定胃黏膜Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子88(MyD88)、核因子κB(NF-κB)基因表达。结果:各给药组大鼠胃黏膜病变有显著减轻,炎性细胞浸润程度和固有腺体萎缩程度的组间差异均有统计学意义(P<0.01);与模型组相比,苦参碱高、低剂量组大鼠血清GAS含量显著升高(P<0.01),血浆SS含量则出现显著降低(P<0.01);苦参碱高、低剂量组大鼠胃黏膜IL-1β、IL-6和TNF-α水平均有显著降低,与模型组相比组间差异均有统计学意义(P<0.01);与模型组相比,苦参碱高剂量组大鼠胃黏膜TLR4、MyD88和NF-κB mRNA相对表达量均有显著降低(P<0.05或P<0.01),苦参碱低剂量组TLR4和NF-κB mRNA相对表达量均有显著降低(P<0.05或P<0.01)。结论:苦参碱可通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号转导通路的持续活化及相关炎症细胞因子的高表达,减轻CAG炎症反应,阻止炎症细胞对胃黏膜造成的损伤,发挥对胃黏膜的保护作用。