TLR2/4配体增强的非特异性肝脏炎症对BALB/c小鼠自身免疫性肝炎的影响

目的:探索非特异性肝脏炎症诱导BALB/c小鼠产生自身免疫性肝炎(AIH)的原因。方法:尾静脉注射质粒pCYP2D6、pcDNA3.1和psTLR2/4,腹腔重复注射四氯化碳(CCl_4)。ELISA检测抗CYP2D6抗体和自身抗体水平;HE染色检测肝脏炎症情况;天狼星红染色检测肝脏纤维化情况。结果:CCl_4引发BALB/c小鼠产生非特异性肝脏炎症,TLR2/4配体增强了这种炎症。停止注射CCl_4后,非特异性肝脏炎症消失,但是却促进模拟抗原人CYP2D6诱导产生自身免疫应答、自身免疫性肝炎和肝纤维化,且TLR2/4配体增强了这些变化。结论:TLR2/4增强的肝脏非特异性炎症在BALB/c小鼠自身免疫性肝炎的启动和发展中可能发挥了重要作用。

体外TLR3配体增强鸭坦布苏病毒灭活苗效果的免疫机制研究

为了阐明TLR3配体对鸭坦布苏病毒(DTMUV)灭活苗的免疫增强作用,以TLR3配体poly(I:C)和灭活DTMUV作用雏鸭外周血单个核细胞(PMBC),通过体外检测TLR3相关信号蛋白和细胞因子转录及表达水平,明确TLR3配体发挥免疫增强作用的主要信号通路。制备雏鸭PMBC,选择TLR3配体poly(I:C)与灭活DTMUV的不同组和与雏鸭PBMC相互作用,通过SYBR GreenⅠ荧光定量PCR和间接ELISA方法对细胞因子(IL-6)和干扰素(α-IFN、β-IFN、γ-IFN)的mRNA转录水平和蛋白表达水平进行测定,结果显示各细胞因子和干扰素的mRNA转录水平和蛋白表达均升高。通过SYBR GreenⅠ荧光定量PCR对TLR3相关信号蛋白(TLR3、TRIF、MyD88、NF-κB)的mRNA转录水平测定,结果显示TLR3、TRIF的mRNA转录水平升高显著,MyD88的mRNA转录水平升高不明显。抑制NF-κB的试验组,细胞因子和干扰素mRNA的转录水平显著降低,可见,NF-κB对poly(I:C)+灭活DTMUV组细胞因子和干扰素的产生发挥重要的调节作用。TLR3配体poly(I:C)通过与TLR3结合,激活了TRIF-NF-kB通路,从而引起细胞因子和Ⅰ型干扰素的产生。

小鼠骨髓和腹膜腔来源巨噬细胞的功能差异

目的研究骨髓来源巨噬细胞和腹膜腔巨噬细胞的功能差异,为免疫学研究和免疫调节药物评价中巨噬细胞的选择提供依据。方法利用巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)诱导骨髓单核细胞分化为巨噬细胞,利用巯基乙酸盐培养基诱导腹膜炎获得腹膜腔巨噬细胞,两种巨噬细胞在分别经过酵母多糖(zymosan)、脂多糖(LPS)、雷西莫特(R848)和非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸寡聚体(CpG)四种Toll样受体(TLR)配体诱导后,实时荧光定量PCR测定巨噬细胞肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP-1α)和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)mRNA水平,ELISA检测巨噬细胞培养上清液TNF-α、IL-6、MIP-1α、MCP-1含量,流式细胞术分析细胞表面共刺激分子CD80、CD86、CD40和主要组织相容性复合体Ⅱ(MHCⅡ)的表达。结果两种巨噬细胞在经过不同TLR配体诱导后,炎症因子和趋化因子的mRNA表达水平均有不同程度的增加,腹膜腔巨噬细胞TNF-α、IL-6、MIP-1α、MCP-1分泌水平以及表面CD86和MHCⅡ表达显著高于骨髓来源巨噬细胞。结论骨髓来源巨噬细胞和腹膜腔巨噬细胞均表达炎症因子、趋化因子、共刺激分子和MHCⅡ,腹膜腔巨噬细胞具有更加完整的巨噬细胞功能,在免疫学研究和免疫调节药物评价中可以优选腹膜腔巨噬细胞。

改良细胞因子鸡尾酒诱导肺腺癌细胞总RNA转染树突状细胞疫苗抗肿瘤效应的体内研究

目的探讨不同细胞因子鸡尾酒诱导的树突状细胞(DC)疫苗对裸鼠移植瘤的抗肿瘤作用。方法从38名外周血干细胞移植术供者的外周血中分离单个核细胞(PBMC),诱导成未成熟DC,将人肺腺癌细胞A549总RNA电转染入DC,分别用传统细胞因子鸡尾酒(IL-6、IL-1β、TNF-α、PGE2)和改良细胞因子鸡尾酒(IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2、polyⅠ∶C、CpG ODN)刺激DC成熟。致敏DC与自体T细胞混合培养,诱导产生抗原特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL),用流式细胞术鉴定T细胞表型,ELISA法检测IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5和IL-10的分泌。建立肺腺癌A549荷瘤裸鼠模型,随机分为空白对照组、未成熟组、传统组和改良组(n=5),于肿瘤接种d15、d22、d29给予相应CTL治疗,测量肿瘤体积和重量,免疫组化法和Western blotting检测肿瘤组织COX-2、VEGF、Bcl-2和Bax蛋白表达水平。结果1)CD3+CD8+T细胞表达率(%):未成熟组、传统组和改良组分别为35.00±3.24 vs 57.10±2.69 vs 63.98±1.96(P<0.05);2)IFN-γ浓度(pg/mL):3组分别为160.12±42.01 vs 263.17±55.30 vs 1 034.30±253.07(P<0.05);TNF-α浓度(pg/mL):3组分别为72.72±9.13 vs 65.20±8.03 vs 295.89±123.80(P<0.05);IL-10浓度(pg/mL):3组分别为7.26±1.76 vs 31.06±4.19 vs 44.01±12.12(P<0.05);3组IL-4、IL-5含量均未检测出,可见改良组T细胞分泌Th1型细胞因子IFN-γ和TNF-α的能力较未成熟组和传统组明显增强;3)经CTL免疫治疗后,裸鼠肿瘤体积(mm3):3组分别为512±33 vs 345±63 vs203±52(P<0.05),且改良组抑瘤率最大,为69.62%;4)改良组DC诱导的CTL明显上调Bax的表达,下调COX-2、VEGF和Bcl-2的表达。结论改良细胞因子鸡尾酒诱导肺腺癌细胞总RNA转染的DC疫苗能诱导Th1型免疫应答及产生有效的抗原特异性CTL,对肺腺癌裸鼠移植瘤具有良好的抑制作用。

Toll样受体信号通路在调控树突状细胞成熟中的作用研究

目的探讨TLR信号通路在调控树突状细胞(DC)熟过程中的作用。方法用密度梯度离心法从人外周富集血中分离单个核细胞(PBMC),以GM-CSF和IL-4体外诱导成未成熟DC(imDC),用电穿孔法把A549的总RNA转染入imDC,分别用传统细胞因子鸡尾酒(IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2)和改良细胞因子鸡尾酒(IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2、polyⅠ∶C、CpG ODN)刺激DC的成熟。实验分为4组,对照组:GM-CSF、IL-4;传统组:传统细胞因子鸡尾酒;改良1组:IL-1β、IL-6、TNF-α、polyⅠ∶C、CpG ODN);改良2组:IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2、polyⅠ∶C、CpG ODN。用RTPCR法检测RNA的转染效率,流式细胞术检测DC和DC致敏T细胞的表面标志,ELISA法检测IL-12的分泌水平,MTT法检测T细胞的增殖。结果 1)RT-PCR检测:电穿孔法能使A549的总RNA成功转入DC,并使DC表达组织多肽特异性抗原(TPS)、癌胚抗原(CEA)和细胞角蛋白19片段(Cyfra21-1)等肿瘤抗原。2)流式检测:CD83各组表达率分别为(15.17±1.61)%、(64.33±7.58)%、(60.26±4.18)%和(82.89±3.06)%,CD1a表达率分别为(25.74±6.06)%、(69.37±8.16)%、(61.66±5.82)%和(86.07±5.63)%(P<0.05),各组CD8+T细胞比例分别为(36.43±3.15)%、(61.91±2.33)%、(54.81±2.55)%和(66.78±2.74)%(P<0.05)。3)各组IL-12的分泌水平分别为(55.86±14.07)、(1 243.49±57.57)、(744±49.51)和(2 385±128.98)pg/mL(P<0.05)。4)各组刺激指数分别为11.85±2.61、54.14±3.81、47.57±3.14和64.43±5.88,阳性对照组为135.29±5.06(P<0.05)。结论TLR配体polyⅠ∶C和CpG ODN可以促进DC的分化成熟。