EGCG调节TLR4/MyD88/NF-κB信号通路对特应性皮炎大鼠Th1/Th2平衡的影响

目的 探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对特应性皮炎(AD)大鼠的保护作用及潜在机制。方法 将SPF级SD大鼠分为对照(Control)组、AD模型(AD)组、AD+EGCG治疗(EGCG)组、AD+地塞米松阳性对照(DXM)组、AD+EGCG+TLR4激动剂(TLR4)组,每组18只。根据临床损伤严重程度计算皮肤损伤评分;ELISA检测炎症因子的表达;HE染色观察组织学变化;流式细胞仪分析Th1和Th2阳性细胞比例;Western blot检测TLR4/MyD88/NF-κB通路相关蛋白水平。结果 与Control组比较,AD组大鼠背部皮肤损伤程度较重,病理学损伤评分增加(P<0.05),白细胞介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)水平及Th1细胞百分比降低,白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-13(IL-13)水平及Th2细胞百分比升高(P<0.05),TLR4、MyD88、p-NF-κB蛋白水平升高(均P<0.05)。与AD组比较,EGCG组和DXM组大鼠皮肤损伤评分及皮肤损伤病理学评分降低,Th_1细胞百分比、IL-2、IFN-γ水平升高,IL-4、IL-13水平、Th_(2)阳性百分比、TLR4、MyD88、p-NF-κB蛋白水平下降(均P<0.05)。与EGCG组比较,DXM组大鼠皮肤损伤评分及皮肤损伤病理学评分、Th_1、Th_(2)细胞百分比、TLR4、MyD88、p-NF-κB蛋白水平差异无统计学意义(均P>0.05),TLR4组大鼠皮损评分及皮肤损伤病理学评分升高,皮损组织中Th_1细胞百分比降低,Th_(2)阳性百分比及TLR4、MyD88、p-NF-κB蛋白水平上调(均P<0.05)。结论 EGCG可以通过TLR4/MyD88/NF-κB信号通路,维持Th1/Th2平衡来抑制炎症反应,进而降低AD的严重程度。

鸦胆子苦醇通过TLR9-MyD88信号通路调控Hela细胞凋亡的机制研究

目的探究鸦胆子苦醇(Brusatol,BRU)通过TLR9-MyD88信号通路调控Hela细胞凋亡的分子机制。方法针对本实验室保存的Hela细胞,使用不同浓度(0、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 nmol·L^(-1))的鸦胆子苦醇处理细胞。并将Hela细胞分为Control组(正常培养的Hela细胞)、BRU-L组(使用10.0 nmol·L^(-1)的鸦胆子苦醇处理细胞)BRU-H组(使用20.0 nmol·L^(-1)的鸦胆子苦醇处理细胞)、BRU+pcDNA-NC组(转染pcDNANC+20.0 nmol·L^(-1)的鸦胆子苦醇)、BRU-H+pcDNA-TLR9组(转染pcDNA-TLR9+20.0 nmol·L^(-1)的鸦胆子苦醇)。使用细胞计数试剂盒(CCK-8)法和EdU法检测各组细胞增殖情况;TUNNEL染色法,经流式细胞仪检测细胞凋亡;蛋白免疫印迹(Western blot)检测各组细胞TLR9、MyD88、Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表达水平;流式细胞术检测细胞凋亡和线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)情况、ELISA检测各组细胞三磷酸腺苷(ATP)和活性氧基团(ROS)含量。结果与0 nmol·L^(-1)组比较,10 nmol·L^(-1)组细胞活存活率、IC50值开始显著降低(P<0.05)。不同浓度的BRU刺激细胞后,细胞增殖能力显著降低,且呈剂量依赖(P<0.05)。。与Control组比较,BRU-L、BRU-H组、BRU-H+pcDNA-NC组细胞5-乙炔基-2′-脱氧尿嘧啶核苷(EDU)阳性细胞率、缺口末端标记法(TUNEL)阳性细胞率、细胞凋亡率、细胞Bcl-2蛋白均显著降低,TLR9和MyD88蛋白、Bax、Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平均明显增加(P<0.05);Control组、BRU-L、BRU-H组/BRU-H+pcDNA-NC呈持续递减/递减趋势(P<0.05);与BRU-H+pcDNA-NC组比较,BRU-H+pcDNA-TLR9组EDU阳性细胞率、TUNEL阳性细胞率、细胞凋亡率、细胞Bcl-2蛋白均显著升高,TLR9和MyD88蛋白、Bax、Bax/Bcl-2、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平均明显降低(P<0.05)。与Control组比较,BRU-L、BRU-H组、BRU-H+pcDNA-NC组细胞JC-1水平和ATP含量显著降低,而ROC含量、mitotracker染色阳性细胞水平显著增加(P<0.05);与BRU-L组比较,BRU-H组、BRU-H+pcDNANC组JC-1水平和ATP含量进一步降低,而ROC含量、mitotracker染色阳性细胞水平进一步增加(P<0.05);与BRU-H+pcDNA-NC组比较,BRU-H+pcDNA-TLR9组细胞JC-1水平和ATP含量增加,而ROC含量、mitotracker染色阳性细胞水平降低(P<0.05)。结论鸦胆子苦醇可通过调控TLR9-MyD88信号通路制Hela细胞增殖。

基于TLR2/MyD88/NF-κB信号通路探讨加味少腹逐瘀汤对寒湿瘀结证子宫内膜异位症痛经小鼠腹腔炎症微环境干预作用

目的探讨加味少腹逐瘀汤对寒湿瘀结证子宫内膜异位症痛经小鼠腹腔炎症微环境的干预机制。方法构建动物模型后随机分组。以自主活动次数、粪便含水率、热痛潜伏期评价证候;以子宫及异位病灶大小评价疗效;HE染色比较病理变化;免疫组化检测异位组织中NF-κB的表达及其入核情况;qPCR法和Western blot测定病灶中TLR2、MyD88、NF-κB的mRNA和蛋白表达;ELISA检测TNF-α、IL-6、PGE2、E2、P。结果与假手术组对比,模型小鼠自主活动减少,热痛潜伏期缩短,粪便含水率增加;子宫体积增大,腹腔可见明显异位灶且HE染色显示炎症浸润;免疫组化显示NF-κB表达增加;异位组织TLR2、MyD88、NF-κB mRNA及蛋白表达增加,外周血TNF-α、IL-6、PGE2、E2增高,P下降。与模型组相比,各治疗组子宫体积减小、异位灶重量减轻、疼痛潜伏期延长;中药高剂量组小鼠自主活动次数增加、粪便含水率减少;药物干预后炎症反应改善、NF-κB表达下降;TLR2、MyD88、NF-κB的mRNA及蛋白表达降低;且外周血TNF-α、IL-6、PGE2、E2降低、P升高。结论加味少腹逐瘀汤可以降低寒湿瘀结证子宫内膜异位症小鼠血清炎症因子,这可能与抑制TLR2/MyD88/NF-κB信号通路改善腹腔炎症微环境有关。

基于TLR2/MyD88信号通路探究五味子乙素对全身炎症反应综合征的影响

目的观察五味子乙素(Schisandrin B,SchB)通过TLR2/MyD88信号通路对酵母聚糖诱导的小鼠全身炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome,SIRS)的影响。方法采用腹腔注射酵母聚糖方法造模,记录小鼠体温及白细胞变化,应用酶联免疫吸附法检测血清中TNF-α、IL-1β及IL-6水平,应用试剂盒检测ALT、AST、Cr、BUN含量;HE染色观察各组织病理学变化;应用Western Blot法检测组织中TLR2、MyD88、NF-κB、HMGB1蛋白表达水平。结果SchB使小鼠体温升高显著(P<0.01),白细胞数量增多明显(P<0.01);SchB能显著降低TNF-α、IL-1β、IL-6、ALT、AST、Cr、BUN水平(P<0.001);Western Blot结果显示,SchB能显著降低组织中TLR2、MyD88、NF-κB、HMGB1的表达水平(P<0.01)。结论SchB能够减轻由酵母聚糖导致的SIRS,其作用机制主要是通过调控TLR2/MyD88信号通路缓解炎症。

白芍总苷胶囊联合来氟米特对类风湿关节炎Th1/Th2细胞平衡和外周血单核细胞TLR4/NF-κB信号通路的影响

目的探讨白芍总苷胶囊联合来氟米特对类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者辅助性T细胞(helper T cell,Th)1/Th2细胞平衡和外周血单核细胞Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)/核因子κB(nuclear factorκB,NF-κB)信号通路的影响。方法按照信封抽签法将锦州医科大学附属第一医院2021年4月至2023年12月期间接收的129例RA患者分为对照组(n=64,来氟米特片治疗)和观察组(n=65,白芍总苷胶囊联合来氟米特片治疗)。对比两组疗效、临床症状、病情评分、疾病相关指标、Th1/Th2细胞平衡和TLR4/NF-κB信号通路相关指标,同时观察两组不良反应发生情况。结果观察组的临床总有效率高于对照组(P<0.05)。与对照组相比,观察组治疗2个月后晨僵时间缩短,关节肿胀数和关节压痛数减少,疼痛视觉模拟量表(visual analog scale of pain,VAS)评分和RA患者病情评价(disease activity score 28,DAS28)评分下降,C反应蛋白、红细胞沉降率、类风湿因子下降,Th2细胞升高,Th1细胞、Th1/Th2下降,TLR4信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid,mRNA)、NF-κB mRNA下降(P<0.05)。两组不良反应发生率对比无差异(P>0.05)。结论白芍总苷胶囊联合来氟米特治疗RA患者,可促进患者症状改善,提高临床治疗效果,可能与调节Th1/Th2细胞平衡和抑制外周血单核细胞TLR4/NF-κB信号通路激活有关。

枸杞多糖通过调控TLR9/AP-1信号通路对变应性鼻炎大鼠Th1/Th2细胞因子及鼻黏膜中嗜酸性粒细胞炎症的影响

目的探究枸杞多糖通过调控Toll样受体9/激活蛋白-1(TLR9/AP-1)信号通路对变应性鼻炎大鼠Th1/Th2细胞因子、鼻黏膜中嗜酸性粒细胞炎症的影响。方法选取60只SPF级SD雄性大鼠,随机分为正常(A)组,模型(B)组,糠酸莫米松(C)组,枸杞多糖(D)组,TLR9/AP-1信号通路抑制剂(E)组,TLR9/AP-1信号通路抑制剂联合枸杞多糖(F)组,每组各10只,对B、C、D、E、F组采用卵清蛋白致敏法建立变应性鼻炎模型,A组不建立该模型。建模成功后,对C组给予1喷/侧的糠酸莫米松喷鼻治疗,对D组灌胃100 mg/kg的枸杞多糖,对E组灌胃20 mg/kg AP-1抑制剂SP100030,对F组给予SP100030联合枸杞多糖,A、B组同期给予灌胃同体积生理盐水,对大鼠鼻部症状进行评分,HE染色法检测鼻黏膜组织病理形态及嗜酸性粒细胞并计数,ELISA法检测大鼠血清中Th1/Th2细胞因子水平,免疫印迹法检测鼻黏膜组织中TLR9/AP-1信号通路相关蛋白表达。结果与A组相比,B组鼻部症状评分、鼻黏膜中嗜酸性粒细胞数目、血清IL-4含量显著升高(P<0.05),血清中INF-γ含量显著降低(P<0.05);与B组比较,C、D两组鼻部症状评分、鼻黏膜中嗜酸性粒细胞数目、血清IL-4含量显著降低(P<0.05),血清中INF-γ含量显著升高(P<0.05),且D组比C组变化显著(P<0.05);A组大鼠鼻黏膜组织结构完整,B组鼻黏膜上皮结构紊乱且不完整,出血及嗜酸性粒细胞等炎性细胞浸润;与B组相比,C、D组病理状态明显改善,嗜酸性粒细胞明显减少;与A组比较,B组鼻黏膜组织中TLR9、AP-1蛋白表达显著升高(P<0.05),与B组比较,C、D组鼻黏膜组织中TLR9、AP-1蛋白表达显著降低(P<0.05),且D组比C组变化显著(P<0.05),而E组与D组相比无明显差异(P>0.05),F组比E组降低明显(P<0.05)。结论枸杞多糖可有效调控变应性鼻炎大鼠Th1/Th2细胞因子水平、减轻鼻黏膜中嗜酸性粒细胞炎症,其机制可能与抑制TLR9/AP-1信号通路有关。

肺纤方通过调控HMGB1/TLR2信号通路抑制特发性肺纤维化的实验研究

目的探讨肺纤方通过调控高迁移率族蛋白1(high mobility group protein 1,HMGB1)/Toll蛋白受体2(toll protein receptor 2,TLR2)信号通路对特发性肺纤维化的抑制作用。方法选取健康雄性SD大鼠80只,分为对照组16只和造模组64只。造模组采用博来霉素气管注射法建立特发性肺纤维化模型,对照组给予等量生理盐水气管注射。造模成功后,将造模组大鼠随机分为模型组、肺纤方低、高浓度组及泼尼松组,各16只。模型组和对照组分别给予生理盐水10 mL/kg,1次/d,灌胃给药;肺纤方低、高浓度组分别给予0.72、2.9 g/mL肺纤方药液10 mL/kg,1次/d,灌胃给药;泼尼松组给予1.0 mg/mL醋酸泼尼松溶液10 mL/kg,1次/d,灌胃给药。所有大鼠均连续给药4周。对大鼠肺纤维化程度、血清血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)及肺泡灌洗液炎症因子水平、肺组织HMGB1、TLR2蛋白表达水平进行检测。结果治疗后,与模型组比较,各组大鼠肺纤维化程度评分较低,肺泡灌洗液肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)水平较低,血清PDGF、TGF-β1水平较低,肺组织HMGB1、TLR2蛋白表达水平较低,且肺纤方低浓度组>泼尼松组>肺纤方高浓度组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论肺纤方能明显减轻特发性肺纤维化模型大鼠肺纤维化程度,降低血清细胞因子PDGF、TGF-β1水平,抑制肺部炎症反应,且药物浓度越高效果越明显,其作用可能与下调HMGB1/TLR2信号通路活性有关。

卫矛醇通过调节Toll样受体4/髓样分化因子88/核因子-κB信号通路缓解脂多糖诱导的猪肠道上皮细胞损伤

本试验旨在通过构建猪肠道上皮细胞(IPEC-J2细胞)经脂多糖(LPS)刺激后细胞损伤模型,揭示卫矛醇(DUL)对LPS处理后的IPEC-J2细胞屏障受损和炎症损伤的缓解作用及其可能的分子机制。采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测IPEC-J2细胞活力,以确定LPS造模浓度(150μg/mL)和最佳DUL处理浓度(200μmol/L)。试验设3个组:对照(CON)组、LPS组和DUL组。IPEC-J2细胞贴壁后,CON组先用完全培养基处理24 h,然后用DMEM培养基处理24 h;LPS组先用完全培养基处理24 h,然后用含有150μg/mL LPS的DMEM培养基处理24 h;DUL组先用含有200μmol/L DUL的完全培养基处理24 h,然后用含有150μg/mL LPS的DMEM培养基处理24 h。观察各组IPEC-J2细胞生长状态,划痕试验评价细胞的迁移和增殖能力,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测屏障和炎症相关基因的mRNA和蛋白相对表达水平。结果表明:1)在IPEC-J2细胞上,确定200μmol/L的DUL为最佳处理浓度,150μg/mL的LPS为有效致炎浓度。2)相较于LPS组,DUL预处理缓解了细胞密度降低、细胞空泡增多、细胞边界不清晰的情况。3)相较于LPS组,DUL预处理显著增加了细胞迁移距离和细胞迁移面积(P<0.05)。4)相较于LPS组,DUL预处理显著升高了屏障相关基因闭锁小带蛋白-1(ZO-1)、闭锁蛋白(OCLN)、封闭蛋白1(CLDN1)的mRNA和蛋白相对表达水平及黏蛋白2(MUC2)、大肿瘤抑制激酶1(LATS1)、YES相关蛋白1(YAP1)的mRNA相对表达水平(P<0.05)。5)相较于LPS组,DUL预处理显著降低了通路相关基因髓样分化因子88(Myd88)、核因子-κB抑制蛋白-α(IκB-α)、核因子-κB(NF-κB)、白细胞介素-1β(IL-1β)的mRNA和蛋白相对表达水平和Toll样受体4(TLR4)的蛋白相对表达水平以及核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、白细胞介素-18(IL-18)的mRNA表达相对表达水平(P<0.05)。由此可见,DUL通过下调TLR4/Myd88/NF-κB信号通路相关蛋白表达,调节炎症因子分泌,提高紧密连接相关基因表达,缓解LPS引起的IPEC-J2细胞屏障损伤和炎症反应。

葛根素通过调节TLR4-MyD88-NF-κB信号通路对糖尿病小鼠肾损伤的改善作用

目的:研究葛根素(puerarin)通过调节TLR4-MyD88-NF-κB信号通路对糖尿病小鼠肾损伤的改善作用。方法:小鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ)构建糖尿病小鼠模型,分为糖尿病模型组(模型组)、二甲双胍组、葛根素组,另设正常对照组。正常对照组和模型组小鼠灌胃予生理盐水,二甲双胍组灌胃予二甲双胍320 mg/kg·d^(-1),葛根素组腹腔注射葛根素65 mg/kg·d^(-1),各实验组共干预4周。每周测定各组小鼠的空腹血糖(FBG),称量体重,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定各组小鼠血清肌酐、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α),苏木精—伊红(HE)染色观察小鼠肾组织病理损伤情况,免疫组化观察Toll样受体-4(TLR4)、髓样分化因子88(MyD88)、核因子κB(NF-κB)蛋白在肾组织的表达水平。结果:与正常对照组比较,模型组FBG、肌酐、IL-6、TNF-α水平明显升高(P<0.05),肾小球增大,肾组织正常结构被破坏,肾小球基底膜增厚,且肾组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达增多(P<0.05);与模型组比较,葛根素组的FBG、Scr、IL-6、TNF-a的含量明显降低(P<0.05),减轻肾组织损伤,肾组织TLR4、MyD88、NF-κB表达减少(P<0.05)。结论:葛根素对糖尿病小鼠肾损伤具有明显的改善作用,可能与其调控TLR4-MyD88-NF-κB信号通路有关。

黄芪甲苷对子宫内膜异位症大鼠TLR4-MyD88信号通路的影响

目的分析黄芪甲苷对子宫内膜异位症大鼠的作用及对Toll样受体4(TLR4)-髓样分化因子(MyD88)信号通路的影响。方法将50只SPF级无交配史SD雌性大鼠按随机数字表法分为模型组、对照组和黄芪甲苷低、中、高剂量组,每组10只,除对照组外均构建子宫内膜异位症模型。黄芪甲苷低、中、高剂量组分别给予20、40、80 mg/kg黄芪甲苷灌胃处理,对照组、模型组灌胃等量生理盐水,连续给药28 d。测量各组大鼠异位子宫内膜体积;测定血清性激素指标雌二醇(E_(2))、孕酮(P)、促黄体生成激素(LH)、卵泡刺激素(FSH),以主炎症因子指标肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6、IL-8水平;苏木精-伊红染色观察子宫内膜组织病理变化;蛋白质印迹法(Western blotting)检测子宫内膜异位组织中TLR4-MyD88信号通路蛋白表达。结果与对照组相比,模型组大鼠异位子宫内膜体积增大(P<0.05),以及血清E_(2)、P、LH、TNF-α、IL-6、IL-8水平升高(P<0.05);与对照组相比,模型组大鼠移植内膜生长,被覆柱状上皮,间质较多,可见炎性浸润,子宫内膜组织TLR4、MyD88、p-NF-κB、NF-κB蛋白水平升高(P<0.05)。与模型组相比,黄芪甲苷低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠异位子宫内膜体积缩小(P<0.05),以及血清E_(2)、P、LH、TNF-α、IL-6、IL-8水平下降(P<0.05),且存在剂量依赖性(P<0.05);与模型组相比,黄芪甲苷低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠移植内膜变少,生长不完整,腺体减少或消失,腺上皮萎缩,子宫内膜组织TLR4、MyD88、p-NF-κB、NF-κB蛋白水平均降低(P<0.05),且存在剂量依赖性(P<0.05)。结论黄芪甲苷可剂量依赖地抑制子宫内膜异位症大鼠异位病灶生成,下调性激素水平,降低炎症反应,抑制TLR4-MyD88信号通路激活。

CpG-c41分子对TLR7-MyD88依赖型信号通路的交叉干扰作用

目的探讨TLR9强力拮抗剂CpG-c41分子对TLR7-MyD88依赖型信号通路的交叉干扰作用。方法体外实验采用ELISA法检测CpG-c41对TLR7激动剂ssRNA83刺激RAW264.7细胞24 h诱发的炎症介质TNF-α和IL-6表达的影响,Western blot检测CpG-c41对TLR7-MyD88依赖型信号通路中IκBα蛋白表达的影响;体内实验采用ELISA法检测CpG-c41对ssRNA83攻击BALB/c小鼠2 h诱发血清中TNF-α和IL-6表达的影响作用。结果体内、体外实验均表明,CpG-c41分子能够显著抑制经ssRNA83刺激诱发TLR7-MyD88依赖型信号通路介导的炎症介质TNF-α和IL-6的释放(P<0.01),体外实验表明抑制作用具有量效关系;而Western blot检测显示在CpG-c41作用下,TLR7-MyD88依赖型信号通路中IκBα的降解受干扰。结论 TLR9强力拮抗剂CpG-c41分子通过干扰TLR7-MyD88依赖型信号通路中IκBα的磷酸化降解,抑制炎症介质的释放,发挥对ssRNA攻击小鼠的免疫保护作用。

HMGB1-TLR4-MyD88-NF-κB信号通路在大鼠胸部创伤后心肌损伤的调节机制研究

目的探讨HMGB1-TLR4-MyD88-NF-κB信号通路在胸部创伤多发肋骨骨折后心肌损伤的调节机制,观察心肌损伤后炎性细胞因子IL-4、IL-6、IL-10表达变化。方法(1)根据自由落体原理自制大鼠胸部创伤后多发肋骨骨折伴心肌损伤的模型;(2)实验分组:①对照组;②创伤后4h组、创伤后8h组、创伤后12h组;各组雄性大鼠10只。检测各组心肌组织TLR4、MyD88、NF-κBp65、P-NF-κBp65蛋白含量;检测血浆心肌损伤标志物肌钙蛋白I(cTnI)、HMGB1、IL-4、IL-6、IL-10水平变化。结果与对照组比较,创伤后4h心肌组织TLR4、MyD88、P-NF-κBp65即开始上升;创伤后随时间延长表达明显增高(P<0.05),NF-κBp65无明显的变化;血浆TnI、HMGB1、IL-6水平与对照组比较,创伤后4h即开始上升;且随时间延长表达明显增强(P<0.05),但IL-4、IL-10无明显的上升。结论内源性危险分子HMGB1于胸部创伤后明显表达上升,激活TLR4-MyD88-NF-κB信号通路,同时刺激前炎症细胞因子IL-6等大量释放,加重心肌损伤。

脂多糖通过TLR4-MyD88信号通路诱导BV2小胶质细胞激活模型的建立

目的探讨不同活化程度的BV2小胶质细胞与炎性介质之间的关系及可能的细胞信号转导途径,建立高效稳定的BV2小胶质细胞激活模型。方法体外常规培养BV2小胶质细胞,CCK-8法绘制细胞生长曲线;采用不同浓度的脂多糖(LPS)(0.25、0.5、1、2、4μg/mL)诱导BV2小胶质细胞24 h,倒置相差显微镜下观察细胞形态变化;应用CCK-8法和Griess法分别检测细胞活性和一氧化氮(NO)水平;应用蛋白质印迹法(Western blot)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分别检测Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子88(MyD88)蛋白和mRNA的表达。同时选取浓度为1μg/mL的LPS诱导BV2小胶质细胞24 h,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)浓度。结果 CCK-8法和Griess法结果显示:BV2小胶质细胞传代培养后第2~3天处于对数生长期;LPS能明显降低BV2小胶质细胞存活率及提高NO释放量(均P<0.05),且在实验剂量范围内呈现剂量-效应关系。Western blot和qRT-PCR结果显示:TLR4、MyD88 mRNA及蛋白的表达随着LPS浓度增加呈现先升高后降低的趋势,且均在LPS为1μg/mL时达到峰值(均P<0.05)。ELISA结果显示:LPS(1μg/mL)显著提高TNF-α和IL-1β浓度,与对照组比较差异有统计学意义(均P<0.05)。结论 LPS可能通过TLR4-MyD88信号通路诱导BV2小胶质细胞活化,进而上调其炎性介质的水平;1μg/mL LPS是建立高效稳定BV2小胶质细胞激活模型的最佳浓度。

基于TLR4/MyD88/NF-κB信号通路探讨紫菀散对慢性支气管炎气道炎症的干预作用

目的 观察紫菀散对慢性支气管炎气道炎症的干预作用,并基于Toll样受体4(Toll-like receptors 4,TLR4)/髓分化因子88(myeloid differentiation factor 88,My D88)/核转录因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信号通路探讨其作用机制。方法 60只健康成年雄性SD大鼠随机分为6组,每组10只,除正常组外均采用气管内滴注脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)的方法建立慢性支气管炎模型。醋酸地塞米松组给予0.075 mg·kg-1醋酸地塞米松灌胃,每天1次;紫菀散低、中、高剂量组分别给予1.5、3.0、6.0 g·kg-1紫菀散灌胃,每天1次;模型组、正常组给予等量生理盐水灌胃。采用ELISA法检测支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)水平,采用细胞计数板法计数BALF中白细胞数量,采用HE染色、AB-PAS染色观察肺组织病理改变,采用免疫组化法检测肺组织TLR4、My D88、NF-κB蛋白表达。结果 与正常组比较,模型组TGF-β1、IL-1β、IL-6水平均升高(P<0.01),白细胞总数和各种白细胞数量均增加(P<0.01),肺组织呈病理改变且气道杯状细胞增生评分升高(P<0.01),TLR4、My D88、NF-κB蛋白表达均升高(P<0.01);与模型组比较,醋酸地塞米松组及紫菀散各剂量组TGF-β1、IL-1β、IL-6水平均降低(P<0.05或P<0.01),白细胞总数和各种白细胞数量均降低(P<0.01),肺组织病理改变均减轻,气道杯状细胞增生评分均降低(P<0.05或P<0.01),TLR4、My D88、NF-κB蛋白表达均减少(P<0.05或P<0.01);与醋酸地塞米松组比较,紫菀散中、高剂量组TGF-β1水平均降低(P<0.05或P<0.01),紫菀散低剂量组白细胞总数和各种白细胞数量均增加(P<0.01),紫菀散中剂量组中性粒细胞数量、嗜酸性粒细胞数量均增加(P<0.01),紫菀散高剂量组淋巴细胞数量减少(P<0.01),紫菀散低、中剂量组肺组织病理改变均加重,紫菀散低剂量组气道杯状细胞增生评分升高(P<0.05),紫菀散低剂量组TLR4、My D88、NF-κB蛋白表达均升高(P<0.05)。结论 紫菀散可能通过抑制TLR4/My D88/NF-κB信号通路发挥抗慢性支气管炎气道炎症的作用。

紫杉醇水蛭素支架涂层复合物对HCASMC炎性活化过程中TLR4-MyD88信号通路的影响

目的探讨支架涂层复合物紫杉醇水蛭素对脂多糖(LPS)诱导人冠状动脉平滑肌细胞(HCASMC)炎性活化过程中TLR4-MyD88信号通路的影响。方法选用4-6代的HCASMC,用四唑盐(MTT)比色法筛选出紫杉醇水蛭素支架涂层复合物干预HCASMC的无毒性大、小两个浓度,使细胞活力保持在90%以上。进而将细胞分为空白对照组、脂多糖(LPS)造模组、LPS造模+紫杉醇水蛭素大浓度组、LPS造模+紫杉醇水蛭素小浓度组,其中大、小浓度紫杉醇水蛭素复合物处理组在LPS造模前预处理细胞4 h,继而用Q-PCR法对TLR4和MyD88 mRNA进行检测,并用Western blotting法检测对应蛋白表达的变化。结果 1μmol/L的紫杉醇配比0.8 mg/ml水蛭素对HCASMC生长有明显的抑制作用,细胞活力与空白对照组相比差异明显(P<0.05)。1μmol/L的紫杉醇配比0.4 mg/ml水蛭素干预后细胞活力降低为78.7%,对细胞生长产生了一定影响,其余各浓度组细胞活力均能保持在90%以上。紫杉醇水蛭素复合物预处理细胞4 h后,Q-PCR结果显示,与空白对照组相比,LPS造模后可同时激活TLR4、MyD88的mRNA表达(P<0.05),HCASMC炎症模型构建成功。各干预组经紫杉醇水蛭素处理后,与单纯LPS模型组相比,TLR4的mRNA基因表达量显著降低(P<0.05),但不影响MyD88基因表达(P>0.05)。Western blotting结果显示:与空白对照组相比,LPS模型组TLR4、MyD88蛋白表达明显升高(P<0.05),成功构建了稳定的HCASMC炎症模型。经紫杉醇水蛭素处理后,各干预组TLR4、MyD88蛋白表达较LPS模型组显著降低(P<0.05),其中紫杉醇水蛭素大浓度组的抗炎作用相对更强。结论紫杉醇水蛭素支架涂层复合物对LPS诱导的HCASMC细胞炎性活化过程中TLR4-MyD88通路的激活具有明显的抑制作用,此抑制作用不通过影响MyD88基因表达来产生,而可能与其对MyD88蛋白水平的调控有关。

隐丹参酮对ACA、Anti-β_2-GP_1阳性大鼠抗体水平及TLR4/NF-_κB信号通路影响的研究

目的研究隐丹参酮对抗心磷脂抗体(ACA)、抗β2糖蛋白1抗体(anti-β2-GP1)阳性模型SD大鼠抗体水平及TLR4/NF-κB信号通路的影响。方法将SD雌性大鼠随机分为6组,即隐丹参酮组(0.03μg/g)、丹参注射液组(6μl/g)、阿司匹林组(0.04μg/g)、水溶剂组(与隐丹参酮组相同体积吐温80与0.9%Na Cl溶液的混合液)、模型组(与隐丹参酮组相同体积0.9%Na Cl溶液)、空白组(与隐丹参酮组相同体积0.9%Na Cl溶液)。采用腹腔注射地塞米松注射液及盐酸肾上腺素注射液造模,共16日。于造模完成后第1天开始灌胃给药,连续2周。造模完成后及灌胃结束后采血,采酶联免疫吸附法(ELISA法)检测血清中ACA、Anti-β2-GP1水平,再将雌雄大鼠合笼,受孕的第12天将大鼠处死。用ELISA法检测血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)的水平并计算活胎数。取大鼠子宫蜕膜组织,采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(SP)法测定Toll样受体4(TLR4)蛋白的表达水平。结果 1隐丹参酮可以有效降低血清中ACA、Anti-β2-GP1的水平,提高大鼠活胎数。2隐丹参酮可以使大鼠子宫蜕膜细胞内TLR4的表达水平降低,从而降低血清中TNF-α水平,降低妊娠风险。结论隐丹参酮可有效降低ACA、Anti-β2-GP1阳性大鼠的流产率,其机制可能与抑制TLR4/NF-κB信号通路有关。

泄浊解毒方对溃疡性结肠炎大鼠TLR2/IκB-α/IL-1β信号通路的影响

目的:观察泄浊解毒方对溃疡性结肠炎(UC)模型大鼠TLR2/IκB-α/IL-1β信号通路的影响。方法:将大鼠随机分为正常组、模型组、柳氮磺胺吡啶组、泄浊解毒方小剂量组、泄浊解毒方大剂量组,除正常组外其余各组小鼠采用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇混合溶液灌肠复制溃疡性结肠炎大鼠模型,观察经药物处理后各组大鼠结肠组织TLR2、IκB-α和血清IL-1β的表达。结果:泄浊解毒方可明显减少UC模型大鼠结肠组织TLR2、IκB-α和血清IL-1β的表达。结论:泄浊解毒方对大鼠溃疡性结肠炎有良好的治疗作用,其作用机制可能与调节TLR2/IκB-α/IL-1β信号通路有关。

HMGB1通过TLR2-Myd88途径调控糖尿病中vWF水平

目的探究高迁移率族蛋白(1 HMGB1)-TLR2-MyD88通路在调节糖尿病中血管性血友病因子(vWF)水平的作用。方法使用四氧嘧啶建立糖尿病小鼠模型,使用TLR2抑制剂和激动剂以及HMGB1抑制剂观察糖尿病小鼠中HMGB1-TLR2-MyD88通路中蛋白水平的变化以及小鼠骨巨噬细胞和血浆中vWF含量。结果糖尿病小鼠中骨巨噬细胞vWF含量比正常小鼠高(P<0.05),使用TLR2激动剂后正常小鼠中TLR2、MyD88和vWF水平升高(P<0.05),使用TLR2沉默RNA刺激糖尿病小鼠,可降调TLR2、MyD88和vWF水平(P<0.05)。糖尿病小鼠组中HMGB1水平高于正常小鼠组(P<0.05),且使用HMGB1抑制剂后TLR2/MyD88通路以及vWF水平下调(P<0.05)。结论本研究表明糖尿病小鼠中表达升高的HMGB1可作为TLR2的一种内源性配体激活TLR2-MyD88通路调节血浆中vWF水平。

薯蓣皂苷元对缺血性脑卒中大鼠神经运动功能及TLR4-MyD88/TRIF信号通路调节作用研究

目的:研究薯蓣皂苷元对缺血性脑卒中大鼠神经运动功能及TLR4-MyD88/TRIF信号通路的调节作用。方法:将大鼠随机分为假手术组、缺血性脑卒中模型组、薯蓣皂苷元低、中、高剂量组及阳性对照组,每组12只。采用四血管阻断法建立缺血性脑卒中大鼠模型,薯蓣皂苷元各剂量组分别灌胃给予12.5 mg/kg、25 mg/kg及50 mg/kg的薯蓣皂苷元,阳性对照组给予大鼠尼莫地平,1次/d,连续21 d。测定给药前后大鼠神经功能缺损评分,使用Morris水迷宫测定大鼠逃避潜伏期及90 s内穿过平台的次数;酶联免疫吸附(ELISA)法测定脑组织Toll样受体(TLR)-2、白介素(IL)-1β、IL-6及肿瘤坏死因子(TNF)-α水平;苏木精—伊红(HE)染色法测定脑组织病理改变;实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)及免疫印迹法(Western blotting)测定大鼠脑组织TLR4、MyD88、TRIF mRNA及蛋白水平。结果:与缺血性脑卒中模型组比较,薯蓣皂苷元各剂量组及阳性对照组大鼠神经功能缺损评分、逃避潜伏期、脑组织TLR-2、IL-1β、IL-6及TNF-α水平,脑组织TLR4、MyD88及TRIF mRNA及蛋白水平均明显降低(均P<0.05),90 s内穿越平台次数显著增加(P<0.05),大鼠脑组织病理性变化明显恢复,且各项指标变化与薯蓣皂苷元的剂量表现出依赖性。结论:薯蓣皂苷元能够修复缺血性脑卒中大鼠神经运动功能及神经损伤,抑制脑组织炎症反应,其机制可能与调节TLR4-MyD88/TRIF信号通路有关。

人参皂苷Rg1通过TLR4/MyD88/NF-κB p65通路调控小鼠急性肾损伤诱导的急性肝损伤的机制研究

目的:探讨人参皂苷Rg1(GRg1)对小鼠急性肾损伤所诱导的急性肝损伤的保护作用及其调控机制。方法:昆明小鼠随机分为假手术(sham)组、模型(model)组、GRg1组和necrostatin-1 (Nec-1)组,每组10只。制备急性肾损伤模型,24 h后收集血液。采用生化试剂盒检测小鼠血清肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)、天冬氨酸转氨酶(AST)、谷氨酸转氨酶(ALT)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平。采用ELISA法检测炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达。HE染色观察组织病理学改变,采用免疫组织化学和Western blot法检测TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白的表达水平。结果:与假手术组比较,model组小鼠出现明显的肝细胞坏死、肝肾功能减退,血清中SCr、BUN、AST和ALT均显著升高(P<0.01),MDA含量显著上升,SOD活性显著降低(P<0.01),且血清中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α含量显著升高(P<0.01),TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白表达显著增高(P<0.01);与model组相比,GRg1和Nec-1组处理后小鼠肝细胞坏死减轻,肝肾功能显著改善(P<0.01),血清中SCr、BUN、AST和ALT水平显著降低(P<0.01),MDA含量显著降低,SOD活性显著增高(P<0.01),血清中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α含量显著降低(P<0.01),TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白表达显著降低(P<0.01);GRg1组和Nec-1组小鼠上述指标比较差异无统计学意义。结论:GRg1可以改善小鼠急性肾损伤所致急性肝损伤的肝肾功能,其机制可能与抑制TLR4/MyD88/NF-κB p65信号通路有关。