斑点叉尾TLR20和TLR21基因在不同细菌和病毒感染后的表达特征

应用实时荧光定量PCR技术,检测了TLR20和TLR21基因在斑点叉尾Ictalurus punctatus感染迟钝爱德华氏菌Edwardsiella tarda、链球菌Streptococcus iniae、嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila和斑点叉尾呼肠孤病毒(Channel Catfish Hemorrhage Reovirus,CCRV)后,在0、12、24、48、72h、7d,肝脏、头肾、脾脏、肠中的时空表达特征。结果显示,4种病原均能引起斑点叉尾TLR20、TLR21基因在所测免疫相关组织中表达量的变化,但呈现出不同的表达模式:感染嗜水气单胞菌后这两种基因的表达差异巨大,而TLR21基因的表达变化不大,在肝脏和头肾中表达量仅在3倍以内变化。感染爱德华氏菌后,TLR20、TLR21两种基因的表达模式类似,在肝脏中表达量显著上调。链球菌引起肝脏TLR20表达量发生4 360倍的变化,远远高于TLR21基因在同组织中的表达量(257.8倍)。斑点叉尾呼肠孤病毒感染引起TLR20、TLR21两种基因在肝脏、头肾的上调表达,肠、脾脏的下调表达。以上结果表明了TLR20、TLR21在斑点叉尾天然免疫应答中起重要作用,为研究鱼类疾病防御机制提供了理论参考。

日本鳗鲡TLR21基因的鉴定、免疫应答与启动子分析

为研究TLR21(Toll like receptor 21)在低等脊椎动物中的功能及表达调控机制,我们扩增获得了日本鳗鲡TLR21(Aj TLR21)c DNA序列,其编码的蛋白具有TLR家族的共同特征。Aj TLR21基因结构与其他鱼类和两栖类TLR21相同,由单个外显子编码。荧光定量结果显示,Aj TLR21在血液、鳃、脾脏、中肾等11个组织/器官中转录表达,其中在血液中表达量最高。经Poly I:C诱导后8h,Aj TLR21在脾脏和中肾中的表达量显著性上调;诱导后16h,Aj TLR21在血液、鳃、肠和脾脏中的表达量显著性上调(P<0.05)。双荧光素酶报告基因结果显示,在Aj TLR21 5′上游调控序列–1179 bp到+117 bp存在Poly I:C调节的正调控元件。经Edwardsiella tarda诱导后16h和72h,Aj TLR21分别在血液和中肾组织的表达量显著性上调,表明Aj TLR21同时也参与了抗细菌免疫应答,其在机体免疫系统中的功能具有多样性。研究对于理解日本鳗鲡Aj TLR21的免疫学功能具有重要的理论意义和应用价值。

pri-miR-21重组腺病毒载体构建及其对TLR4基因调控的研究

目的:构建能高效表达成熟miR-21小分子的腺病毒载体,探讨其对TLR4基因的靶向调控关系。方法:以正常小鼠基因组DNA为模板,PCR扩增pri-miR-21基因,克隆至穿梭载体pAdTrack-CMV中经PCR、酶切及基因测序分析正确无误后,与pAdEasy-1腺病毒骨架质粒进行同源重组,并利用293A细胞,包装成pri-miR-21重组腺病毒感染HeLa细胞,通过Western blot检测TLR4的蛋白表达水平,验证miR-21与TLR4靶向调控的关系。结果:经PCR、酶切、测序及GFP表达证实,成功构建携带pri-miR-21基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。Western blot证实,miR-21可抑制TLR4蛋白的表达。结论:所制备的小鼠pri-miR-21重组腺病毒,可以高效表达成熟miR-21小分子,能够抑制靶基因TLR4的表达。

牙鲆(Paralichthys olivaceus)TLR21基因在迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)感染后的表达特征

应用荧光定量PCR技术,检测了TLR21基因在牙鲆(Paralichthys olivaceus)感染迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)后,在0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、1 d、3 d、6 d后,在心脏、肝脏、脾脏、头肾、鳃、小肠、肌肉和血的时空表达特征,并探讨了它们与牙鲆先天免疫反应的关系。结果表明,大多组织在感染病原6 h后TLR21基因表达明显上调,尤其是头肾和小肠。头肾6 h的表达量达到了对照组的59.3倍,小肠6 h的表达量为对照组的38.6倍。迟缓爱德华氏菌感染引起牙鲆体内各组织中TLR21的上调表达和变化,为研究牙鲆对迟缓爱德华氏菌的防御机制提供了理论依据。

线纹海马Hippocampus erectus的tlr21基因结构及其对CpG-ODN的应答特征

作为先天性免疫反应中重要的模式识别受体之一,TLR(toll-likereceptor)基因家族介导的先天性免疫是脊椎动物抵御病原微生物的重要防线。研究分析了线纹海马Hippocampus erectus tlr21基因的序列特征,并基于抗原注射实验探讨了海马tlr21的免疫功能。线纹海马tlr21基因的开放阅读框长度为2946bp,编码981个氨基酸,预测其编码蛋白相对分子量为246.98kDa,理论等电点为4.78。tlr21编码蛋白主要包含1个信号肽和3个功能结构域:胞外区具有14个富含亮氨酸重复序列的结构域(LRR),跨膜区具有富含半胱氨酸的结构域,胞内区则具有TIR结构域。同源性比较和系统进化分析表明,线纹海马tlr21基因与虎尾海马Hippocampuscomestlr21基因的同源性最高,其次与斜带石斑鱼Epinephelus coioides、牙鲆Paralichthys olivaceus、大菱鲆Scophthalmus maximus和红鳍东方鲀Takifugu rubripes的tlr21基因聚为一枝。tlr21基因在线纹海马的脑、鳃、肝、肠、肾、性腺、肌肉和育儿袋各组织均有分布,肾脏中表达量最高。抗原注射实验结果发现,线纹海马Tlr21对不同类型CpG寡脱氧核苷酸(CpG-ODNs)的识别能力存在差异,其中,CpG-2007和CpG-HC4040对海马肾脏tlr21的mRNA表达量具有显著的促进作用(P<0.05)。研究表明,线纹海马Tlr21能够通过识别含CpG序列的DNA发挥免疫识别作用,研究结果将有助于系统认识海马免疫系统中TLR家族基因的功能特征,为建立海马病害防治策略提供理论依据。

在Hela细胞中验证miRNA-21对TLR4的调控

背景:mi RNA通过调节特异靶基因的表达,在疾病的发展及预后中起着重要作用。目的:探索mi RNA-21在宫颈癌Hela细胞中对TLR4基因的调控关系。方法:通过miR NA靶基因预测网站寻找可能与miR NA-21相互作用的靶基因,利用已构建的携带pri-mi RNA-21基因重组腺病毒载体,包装并大量扩增病毒感染Hela细胞,检测荧光蛋白的表达水平,提取感染48 h蛋白,通过Western印迹检测TLR4蛋白表达。从蛋白水平验证在Hela细胞中mi RNA-21与靶基因TLR4的靶向调控关系。结果与结论:100 MOI的重组腺病毒p Ad/pri-miR NA-21、p Ad/neg可以成功感染Hela细胞。生物信息学方法显示mi RNA-21和TLR4存在可能的结合位点。发现感染pA d/pri-miR NA-21组与对照组pA d/neg及空白组相比,TLR4蛋白的表达量明显降低。证实了mi RNA-21可以负调节靶基因TLR4的表达。

miR-21在巨噬细胞对MRSA感染过程中免疫应答的调控

目的建立耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的体外感染模型,研究miR-21的生物学功能及其在巨噬细胞中对MRSA感染过程中的免疫应答调控机制,以期为临床提供更多关于MRSA感染的相关免疫应答信息,为临床治疗提供参考数据和新的治疗思路。方法利用前期冻存的高效表达成熟miR-21的重组腺病毒颗粒pAd/pri-miR-21感染小鼠巨噬细胞RAW264.7。利用MRSA感染已经侵染腺病毒颗粒pAd/pri-miR-21的细胞,建立感染模型,Real-Time PCR检测TLR4、NF-κB和IL-6 mRNA水平的表达。结果 miR-21可下调TLR4基因的表达,降低TLR/4Myd88/NF-κB下游分子NF-κB、IL-6的活性。结论证实miR-21对TLR/4Myd88/NF-κB信号通路具有负向调控作用,在MRSA感染的巨噬细胞的免疫调控中发挥着重要的作用。