利用ICR小鼠模型对PCV2感染中TLR3信号通路的研究

为探究猪圆环病毒2型(PCV2)感染对TLR3信号通路及炎性细胞因子的影响,本研究将30只6周龄ICR雌鼠随机分成两组(感染组和对照组),腹腔接种PCV2b/YJ株,在接种后第7 d、14 d、21 d、28 d和35 d采集小鼠外周血及脾组织。以临床观察、脾组织PCV2基因拷贝、小鼠血清抗体效价、IL-10和TNF-α的mRNA水平等指标评估感染模型;荧光定量PCR检测小鼠脾组织TLR3、TRIF、IFN-β、Mx1的mRNA水平,western blot检测TLR3蛋白表达水平。结果显示:PCV2感染期间感染组小鼠无可见的临床症状,第7 d至35 d感染组小鼠脾组织PCV2基因拷贝数呈逐渐降低趋势,PCV2的IPMA血清抗体在感染后第7 d转阳、35 d达到最高,IL-10 mRNA在感染后第14 d起升高、维持高水平;TNF-αmRNA在感染后第21 d和28 d升高。在感染后第7 d和14 d感染组小鼠TLR3、TRIF mRNA和TLR3蛋白表达水平显著升高;IFN-βmRNA在感染后第7 d具有显著升高过程;Mx1 mRNA在感染后第14 d时有上调过程。本实验在建立PCV2b/YJ亚临床感染ICR小鼠模型的基础上,体内实验表明PCV2感染小鼠激活了TLR3信号通路。本研究为利用敲除小鼠模型阐明TLR3参与PCV2感染引发的免疫应答机制奠定了基础。

基于TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路探讨黄连解毒汤对冠状动脉性心脏病小鼠心肌保护作用

目的 研究基于Toll样受体4(TLR4)/核转录因子-κB(NF-κB)/NOD样受体蛋白3(NLRP3)信号通路探讨黄连解毒汤对冠状动脉粥样硬化性心脏病(CHD)小鼠心肌保护作用。方法 50只6周的雄性SD小鼠中取10只作正常对照组,其余小鼠给予高脂饮食建立CHD模型。采用随机数字表法将40只模型小鼠分为模型组、黄连解毒汤低、中、高剂量组,每组各10只。黄连解毒汤低、中、高剂量组每日分别以10、20、40 g/kg剂量进行灌胃,每日1次,持续6周;正常组、模型组每日给予等量蒸馏水灌胃。干预后采用生化法检测各组总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)水平,酶联免疫吸附试验检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛、内皮素水平;采用苏木精-伊红染色法观察小鼠心肌细胞病理形态,蛋白质印迹法检测心肌组织中TLR4、NF-κB、NLRP3的表达。比较各组小鼠血脂、心肌组织中抗氧化相关指标和TLR4、NF-κB、NLRP3的表达。结果 模型组、黄连解毒汤低、中、高剂量组血脂水平均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);黄连解毒汤低剂量组与模型组血脂水平比较,差异无统计学意义(P>0.05);黄连解毒汤中、高剂量组总胆固醇、甘油三酯、LDL水平均低于模型组,HDL水平高于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。模型组、黄连解毒汤低、中、高剂量组心肌组织中SOD水平均低于对照组,丙二醛、内皮素水平均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);黄连解毒汤低、中、高剂量组SOD水平均高于模型组,丙二醛、内皮素水平均低于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。对照组心肌纤维排列整齐,横纹清晰且细胞完整,无细胞肿胀、炎症浸润等;模型组心肌纤维排列紊乱,结构发生异常,有严重细胞肿胀、炎症浸润;黄连解毒汤低、中、高剂量组未见心肌纤维断裂,黄连解毒汤中、高剂量组细胞肿胀和炎症浸润情况优于黄连解毒汤低剂量组,黄连解毒汤高剂量组优于黄连解毒汤中剂量组。模型组、黄连解毒汤中、高剂量组TLR4、NF-κB、NLRP3蛋白表达量均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);黄连解毒汤低、中、高剂量组TLR4、NF-κB、NLRP3蛋白表达量均低于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。且黄连解毒汤各剂量组中以上指标变化呈剂量依赖性。结论 黄连解毒汤能降低CHD小鼠血脂水平,保护心肌细胞,其能够通过下调组织TLR4、NF-κB、NLRP3蛋白表达以调节血脂水平并改善心肌功能,且黄连解毒汤的效果随着剂量的增加而增强。

TLR4/miR-223/NLRP3信号通路的表达与脑卒中后抑郁大鼠海马炎症反应的关系

目的探究Toll样受体4(TLR4)/miR-223/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)信号通路的表达与脑卒中后抑郁(PSD)大鼠海马炎症反应的关系。方法30只3月龄SPF级健康雄性Sprague-Dawley大鼠分为假手术组,PSD模型组和TLR4抑制剂组,各10只。PSD模型组和TLR4抑制剂组建立PSD模型,TLR4抑制剂组给予0.3 mg/kg的TAK-242溶液腹腔注射,其余各组均腹腔注射等体积的生理盐水溶液,5次/周,连续4周。评定各组大鼠的神经行为学,ELISA法检测血清白介素-1β(IL-1β)和IL-10的表达水平,RT-PCR测定海马组织中TLR4/miR-223/NLRP3信号通路相关基因的表达,Western blot测定TLR4/miR-223/NLRP3信号轴蛋白的相对表达。结果与假手术组相比,PSD模型组和TLR4抑制剂组大鼠Longa评分以及血清IL-1β和IL-10的表达升高,糖水偏嗜比(SP)、移动情况(LA)显著降低(P<0.05);与PSD模型组相比,TLR4抑制剂组大鼠Longa评分以及血清IL-1β和IL-10的表达表达下降、LA和SP升高(P<0.05)。与假手术组相比,PSD模型组大鼠海马组织中TLR4 mRNA、miR-223和NLRP3 mRNA以及TLR4、NLRP3、IL-1β和IL-10蛋白的相对表达均显著升高(P<0.05);与PSD模型组相比,TLR4抑制剂组的TLR4 mRNA和NLRP3 mRNA以及TLR4、NLRP3、IL-1β和IL-10蛋白的相对表达显著降低,miR-223的表达显著升高(P<0.05)。结论TLR4/miR-223/NLRP3信号转导通路与PSD海马炎症反应密切相关,通过调控TLR4/miR-223/NLRP3信号转导通路可能成为临床防治PSD的新靶位和新思路。

基于TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路探讨柴胡皂苷B2对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的影响

目的探讨柴胡皂苷B2对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的影响。方法大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、依那普利(10 mg/kg)组和柴胡皂苷B2低、中、高剂量组(5、10、20 mg/kg),每组12只。除假手术组外,其余5组建立单侧输尿管梗阻(UUO)模型,各组灌胃给予相应药物,每天1次,连续给药2周。全自动生化分析仪检测大鼠血清中血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)水平,ELISA法检测大鼠血清TNF-α、IL-1β水平,Masson染色观察大鼠肾组织病理学变化,试剂盒检测大鼠肾组织中肾上腺髓质素(ADM)水平,免疫组化法检测大鼠肾组织中E-钙黏蛋白(E-cadherin)、转化生长因子-β1(TGF-β1)阳性表达,Western blot法检测大鼠肾组织中TLR4、NF-κB、p-NF-κB、NLRP3蛋白表达。结果与假手术组比较,模型组大鼠肾组织可见肾小管扩张,上皮细胞出现部分空泡化,肾间质内大量炎性细胞浸润、纤维细胞生成及胶原纤维沉积,血清BUN、Scr、TNF-α、IL-1β水平、肾组织TGF-β1阳性表达、TLR4、p-NF-κB/NF-κB、NLRP3蛋白表达升高(P<0.05),肾组织ADM水平、E-cadherin阳性表达降低(P<0.05);与模型组比较,柴胡皂苷B2各剂量组大鼠肾脏病变逐渐减轻,血清BUN、Scr、TNF-α、IL-1β水平,肾组织TGF-β1阳性表达,TLR4、p-NF-κB/NF-κB、NLRP3蛋白表达均降低(P<0.05),肾组织ADM水平、E-cadherin阳性表达均升高(P<0.05);与柴胡皂苷B2高剂量组比较,依那普利组上述指标无明显变化(P>0.05)。结论柴胡皂苷B2能够缓解UUO大鼠肾间质纤维化,改善肾功能和炎症反应,可能与抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路的表达有关。

白虎加桂枝汤对急性痛风性关节炎大鼠TLRs和NALP3信号通路的影响

目的分析白虎加桂枝汤对急性痛风性关节炎(acute gouty arthritis,AGA)大鼠TLRs和NALP3信号通路的影响。方法于SD大鼠右侧踝关节处注入200μL尿酸钠溶液以构建AGA模型,本研究中最终成功构建40只AGA大鼠模型。将造模成功的大鼠随机分为模型组、低剂量组(0.265 g/100 g)、中剂量组(0.53 g/100 g)、高剂量组(1.06 g/100 g),每组各10只,并纳入10只健康SD大鼠为对照组,低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠分别灌胃不同剂量的白虎加桂枝汤,模型组和对照组灌胃等体积生理盐水,各组均连续灌胃7 d,并标准饲养。比较各组大鼠不同时刻踝关节周长、尿酸、血肌酐、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平、步态评分和滑膜组织中NALP3、TLRs相关蛋白及其mRNA表达水平。结果灌胃1、3、7 d时对照组大鼠的踝关节周长、尿酸、血肌酐、IL-1β、TNF-α水平、步态评分最低,且呈现剂量反应(P<0.05)。灌胃1、3、7 d时对照组大鼠滑膜组织中NALP3、TLR3、TLR7蛋白表达及其mRNA表达最低,且呈现剂量反应(P<0.05)。结论白虎加桂枝汤能够改善AGA大鼠的炎症反应,改善肾功能,减轻踝关节组织病理损伤,其机制可能与抑制TLRs和NALP3信号通路相关。

绿原酸联合连翘苷调控细胞因子风暴的网络药理分析及基于TLR4/TRAF6/PI3KC3通路的协同抗炎作用

目的基于网络药理学和体外实验探究绿原酸联合连翘苷调控细胞因子风暴的机制。方法利用Swiss Target Prediction、PharmMapper、SEA和TCMSP数据库预测绿原酸和连翘苷的靶点,在GeneCards、OMIM、DRUGBANK和DisGeNET数据库获取细胞因子风暴的靶点,筛选交集靶点绘制Venn图,以STRING数据库和Cytoscape软件构建蛋白质相互作用网络,采用DAVID数据库进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析。以脂多糖(LPS)诱导RAW264.7巨噬细胞构建细胞因子风暴模型;采用细胞计数试剂-8(CCK-8)法检测巨噬细胞存活率;采用Griess法检测细胞上清液中一氧化氮(NO)含量;以酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧化酶-2(COX-2)的水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测TNF受体相关因子(TRAF4)、TNF受体相关因子6(TRAF6)、磷酸肌醇-3-激酶3(PIK3C3)蛋白表达。结果网络药理分析获得绿原酸联合连翘苷治疗细胞因子风暴的8个核心网络靶点[丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1)、白蛋白(ALB)、低氧诱导因子1α(HIF1A)、IL-6、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)、酪氨酸激酶(SRC)、Toll样受体4(TLR4)];富集关键通路包括PI3K/AKT信号通路等。体外实验结果显示,与对照组比较,模型组中NO、TNF-α、IL-6的释放量和iNOS、COX-2蛋白表达量均显著升高(P<0.001)。与模型组比较,给药后NO、TNF-α、IL-6、iNOS、COX-2的水平均显著降低(P<0.001)。与单药给药组比较,绿原酸和连翘苷(1∶1)联合用药组炎症指标下降更明显(P<0.001)。与模型组比较,给药组TLR4、TRAF6、PI3K3C的蛋白表达和PI3K3C的磷酸化水平显著下降。结论绿原酸联合连翘苷能协同抑制促炎细胞因子的表达,调控细胞因子风暴,可能通过TLR4/TRAF6/PI3K3C信号通路实现。

阿替普酶联合红花提取物调节TLR4-NLRP3信号通路对大鼠急性脑梗塞的影响

目的:研究阿替普酶静脉溶栓联合红花提取物对急性脑梗塞的改善作用及潜在机制。方法:30只SD大鼠,随机选取6只作为假手术组,其余大鼠均构建急性脑梗塞模型。模型构建成功后,随机将造模大鼠分为模型组、阿替普酶组(尾静脉注射阿替普酶5mg/kg)、红花提取物组(尾静脉注射4g/kg)、阿替普酶联合红花提取物组,每组6只。各给药组大鼠给予相应干预,假手术组和模型组大鼠注射等体积的无菌0.9%氯化钠溶液,连续7d。通过Zea Longa进行神经功能缺损评分;TTC染色评价梗死面积;HE染色观察组织病理变化;伊文思蓝(Evans blue)含量测定;TUNEL法检测各组细胞凋亡;qRT-PCR检测脑组织TLR4、NF-κB p65、NLRP3 mRNA表达;Western blotting分析脑组织MMP-2、MMP-9、Bax、Bcl-2、TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、NLRP3、caspase1、pro-IL-1β蛋白表达。结果:与假手术组比较,模型组Zea Longa评分显著升高,梗死面积显著增加,EB含量、细胞凋亡率、MMP-2、MMP-9、Bax、TLR4、NF-κB p65、NLRP3、p-NF-κB p65、caspase1、pro-IL-1β蛋白表达及TLR4、NF-κB p65、NLRP3 mRNA表达显著升高,Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05);与模型组比较,阿替普酶联合红花提取物组能显著降低Zea Longa评分及梗死面积,EB含量、细胞凋亡率、MMP-2、MMP-9、Bax、TLR4、NF-κB p65、NLRP3、p-NF-κB p65、caspase1、pro-IL-1β蛋白表达及TLR4、NF-κB p65、NLRP3 mRNA表达显著降低,Bcl-2蛋白表达显著升高(P<0.05)。结论:阿替普酶静脉溶栓联合红花提取物对急性脑梗塞大鼠具有保护作用,其通过抑制TLR4-NLRP3信号通路及减少细胞凋亡,从而改善急性脑梗塞受损的神经功能,是潜在疗法。

破血化瘀、填精补髓方对脑出血模型小鼠脑组织TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路的影响

目的:探讨破血化瘀、填精补髓方治疗脑出血的相关作用机制。方法:野生型小鼠和Nrf2基因敲除小鼠各90只,采用小鼠尾动脉取血向脑内灌注的方法建立脑出血小鼠模型,造模成功后120只小鼠随机分为野生型模型组、野生型方剂组、Nrf2基因敲除模型组、Nrf2基因敲除方剂组,每组30只。另分别取30只野生型小鼠和Nrf2基因敲除小鼠脑内只插入微量注射针数分钟不注血作为野生型假手术组和Nrf2基因敲除假手术组。造模后对野生型方剂组及Nrf2基因敲除方剂组给予破血化瘀、填精补髓方10.41 g·kg^(-1)·d^(-1)灌胃,模型组及假手术组给予等量生理盐水。给药1 d、3 d后检测小鼠的行为学变化及脑含水量变化,3 d后HE染色观察脑组织病理形态学改变,用Western Blot以及免疫组化检测脑组织TLR4、NF-κB、NLRP3蛋白水平。结果:与野生型假手术组相比,野生型模型组小鼠的神经功能评分、脑含水量、HE染色病理细胞数、免疫组化阳性细胞数以及TLR4、NF-κB、NLRP3的蛋白表达水平均升高(P<0.05,P<0.01)。与野生型模型组比较,野生型方剂组小鼠上述各指标均明显改善(P<0.05)。相对于野生型模型组小鼠,Nrf2基因敲除型模型组小鼠上述各指标均有明显改善(P<0.05)。结论:破血化瘀、填精补髓方可以通过抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路抑制氧化反应及炎症反应,从而抑制脑出血后的神经细胞功能损伤,减少继发性脑损伤。

基于外泌体miRNA介导的TLR4/NLRP3信号通路探讨中医药治疗抑郁症的研究进展

抑郁症是目前影响全球3亿多人最普遍、致残率最高的精神疾病之一,主要表现为情绪低落、注意力不集中等。其发病机制十分复杂,目前尚未完全阐明,但已有研究表明神经炎症反应是抑郁症发生发展的关键病理机制,其中TLR4/NLRP3信号通路发挥关键作用。多种miRNA参与调控该炎症通路,与抑郁症发生关系密切,近年来成为国内外研究热点。文章就外泌体miRNA通过TLR4/NLRP3信号通路治疗抑郁症的研究进展进行综述,并列举部分通过该通路发挥抗抑郁作用的中医药,以期为临床上抑郁症的诊断和治疗提供新的方向。

基于TLR4/NF-κB/NLRP3通路探讨参芪调肾方改善CSE诱导小鼠肺泡巨噬细胞炎症反应的作用机制

目的:基于TLR4/NF-κB/NLRP3通路探讨参芪调肾方(SQTS)改善香烟烟雾提取物(Cigarette smoking extract,CSE)诱导小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S)炎症反应的作用机制。方法:以MH-S细胞为研究对象,通过CCK-8法分析SQTS对MH-S细胞的安全性及药效浓度;随后MH-S分为空白组、模型组(8%CSE)和SQTS低、中、高剂量组(40、80、160 mg/L)。ELISA检测细胞上清TNF-α、IL-1β和IL-6含量;DCFH-DA荧光探针法检测细胞中ROS水平;Westernblot检测TLR4/NF-κB/NLRP3通路蛋白的表达,使用TLR4抑制剂TAK-242验证SQTS在TLR4/NF-κB/NLRP3通路上的作用。结果:与空白组比较,CSE组细胞活力降低,炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量增加(P<0.05),ROS荧光表达水平显著升高(P<0.01),TLR4/NF-κB/NLRP3通路蛋白表达明显增加(P<0.05);与模型组比较,参芪调肾方各剂量组细胞活力升高,以上各指标表达水平均有所降低(P<0.05),且TAK-242各组细胞TLR4/NF-κB/NLRP3通路蛋白减少(P<0.05)。结论:参芪调肾方可减轻CSE诱导的MH-S细胞的炎症反应,其机制可能与抑制TLR4/NF-κB/NLRP3通路有关。

白藜芦醇在PD小鼠模型中对TLR3/TRIF信号通路及脑内炎症微环境的影响

目的建立1-甲基-4苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的小鼠PD模型,探究白藜芦醇(resveratrol,Res)对PD小鼠TLR3/TRIF信号通路及中脑黑质炎症微环境的影响。方法雄性C57/BL6小鼠30只,按照随机数字表法分为对照组、MPTP组和MPTP+Res组,每组各10只。对照组腹腔注射相同体积生理盐水;MPTP组腹腔注射生理盐水新鲜配制的MPTP 30mg/(kg·d),连续7d,结束注射7d后取材;MPTP+Res组:Res用乙醇溶解为50mg/mL,用PBS以1∶4的体积比进行稀释,连续注射MPTP 7d后,腹腔注射Res 28d,结束注射7d后取材。采用免疫组化及免疫荧光分别观察小鼠中脑黑质中多巴胺能神经元的变化及小胶质细胞、星形胶质细胞的活化状态。采用实时荧光定量PCR技术检测中脑黑质相关炎症因子mRNA的表达。结果免疫组化结果显示:与MPTP组相比,MPTP+Res组小鼠中脑黑质TH标记的多巴胺能神经元的数量及形态未发生明显变化;CD11b标记的小胶质细胞胞体相对变小,呈圆形及椭圆形,突起减少,变细、变长;而GFAP标记的星形胶质细胞胞体变小,胞体呈圆形,突起变短。qPCR实验结果表明:与MPTP组相比,MPTP+Res组小鼠中脑黑质部位TLR3、IFN-β的mRNA表达量明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),但TRIF的mRNA表达量未见明显变化,促炎因子iNOS、TNF-α的mRNA表达量明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。而抗炎因子Arg^(-1)的mRNA表达量明显增加。结论 Res可能通过抑制小胶质细胞及星形胶质细胞活化及激活TLR3/TRIF信号通路,降低中脑黑质的促炎因子的释放,从而改善MPTP诱导的小鼠PD模型中的炎症微环境。

人参皂苷Rb1介导TLR3/TRIF信号通路对哮喘大鼠的抗炎作用机制

目的探讨人参皂苷Rb1介导Toll样受体(TLR)3/β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TRIF)信号通路对哮喘大鼠模型抗炎作用的影响。方法80只SD大鼠随机分成5组:对照组、模型组、地塞米松组(1 mg/kg)、人参皂苷Rb1低剂量组(100 mg/kg)、人参皂苷Rb1高剂量组(200 mg/kg),每组16只。模型组、地塞米松组、人参皂苷Rb1低、高剂量组建立哮喘大鼠模型,建模成功后地塞米松组、人参皂苷Rb1低、高剂量组给予相应药物灌胃,对照组及模型组给予等量的生理盐水灌胃,每天1次,连续给药14 d。末次给药后24 h,测定大鼠血液淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、动脉血氧分压(PaO_(2))水平,计算大鼠肺/体比值,苏木素-伊红(HE)染色观察肺组织病理学变化,实时荧光定量PCR及蛋白免疫印迹法测定大鼠肺组织中TLR3、TRIF mRNA和蛋白表达水平。结果与对照组比较,模型组大鼠肺/体比值、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞水平、TLR3、TRIF mRNA和蛋白表达水平明显升高,PaO_(2)水平明显降低(P<0.05);与模型组比较,地塞米松组、人参皂苷Rb1低、高剂量组大鼠肺/体比值、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞水平、TLR3、TRIF mRNA和蛋白表达水平降低,PaO_(2)水平升高(P<0.05);且人参皂苷Rb1高剂量组大鼠肺/体比值、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞水平、TLR3、TRIF mRNA和蛋白表达水平低于人参皂苷Rb1低剂量组,PaO_(2)水平高于人参皂苷Rb1低剂量组(P<0.05);与地塞米松组比较,人参皂苷Rb1低剂量组大鼠肺/体比值、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞水平、TLR3、TRIF mRNA和蛋白表达升高,PaO_(2)水平降低(P<0.05);人参皂苷Rb1高剂量组与地塞米松组上述指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论人参皂苷Rb1能够减轻哮喘模型大鼠肺部炎症反应,其机制可能与人参皂苷Rb1抑制哮喘大鼠肺部TLR3、TRIF mRNA和蛋白表达水平进而抑制TLR3/TRIF信号通路的激活有关。

疏风宣肺方和解表清里方对流感病毒H1N1感染人肺腺癌上皮细胞A549中TLR3/7信号通路作用的研究

目的:研究疏风宣肺方和解表清里方体外对人肺腺癌上皮细胞A549中TLR3/7信号通路的影响。方法:利用基因芯片技术研究甲型流感病毒H1N1感染A549细胞后TLR3/7信号通路中基因转录的变化。采用荧光定量PCR和Western blotting法检测各组细胞中的Toll样受体3(Toll-like receptor3,TLR3)、Toll样受体7(Toll-like receptor 7,TLR7)、髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,My D88)、激活核因子Kappa B(nuclear factor-Kappa B,NF-κB)的mRNA及蛋白表达的变化。结果:在TLR3/7相关信号传导通路中,与细胞对照组相比,H1N1感染组差异表达基因Tlr3、Tlr7、Myd88、Nfbk1、Mapk8、Mapk13、Ifna1、Ifnβ1明显上调,奥司他韦组、疏风宣肺组和解表清里组对差异表达基因Tlr3、Tlr7、Myd88、Nfbk1、Mapk8、Mapk13、Ifna1、Ifnβ1明显下调。qRT-PCR结果显示,与细胞对照组比较,H1N1感染组TLR3/7、My D88、NF-κB的mRNA表达均显著升高(P<0.01)。与H1N1感染组比较,疏风宣肺组的TLR3/7、My D88、NF-κB的mRNA表达均明显降低(P<0.05或P<0.01),解表清里方对TLR3/7、NF-κB的mRNA表达均明显降低(P<0.05或P<0.01)。同时,疏风宣肺组治疗效果优于解表清里组。Western blotting结果显示,H1N1感染组TLR3/7、NF-κB蛋白较正常组显著升高(P<0.05)。与H1N1感染组比较,两种方药的TLR3/7、NF-κB表达均显著降低(P<0.05或P<0.01)。结论:疏风宣肺方和解表清里方可以抑制流感病毒H1N1所诱导的TLR3/7信号通路活化,下调活性NF-κB的转录活性,发挥抗流感病毒的作用。

人参皂苷Rb1介导TLR3/TRIF信号通路对慢性哮喘大鼠模型的抗炎作用机制研究

探讨人参皂苷Rb1介导TLR3/TRIF信号通路对慢性哮喘大鼠模型的抗炎作用的影响。方法:100只Wistar大鼠随机分为5组:对照组(A组)、模型组(B组)、布地奈德组(C组)、人参皂苷Rb1低剂量组(D组)、人参皂苷Rb1高剂量组(E组)。建立慢性哮喘大鼠模型,于末次雾化激发后,采血测定淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞水平;随后取肺组织,HE染色,镜下阅片;RT-PCR方法测定肺TLR3、TRIF基因表达水平。结果:与B组比较,C组、D组和E组淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、TLR3、TRIF mRNA表达明显降低(P<0.05),且随着人参皂苷Rb1剂量的增加,淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、TLR3、TRIF mRNA逐渐降低(P<0.05);与C组比较,D组淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、TLR3、TRIF mRNA表达明显升高(P<0.05),但E组和C组比较无明显变化(P>0.05)。结论:人参皂苷Rb1能够降低慢性哮喘模型大鼠肺部炎症反应,其机制可能与人参皂苷Rb1抑制慢性哮喘大鼠肺部TLR3、TRIF mRNA表达水平进而抑制TLR3/TRIF信号通路的激活有关。

H_2S通过抑制TLR4/MyD88/PI3K信号通路减轻尿源性脓毒血症诱导的急性肾损伤

目的:探讨硫化氢(H_2S)减轻尿源性脓毒血症诱导的急性肾损伤的作用机制。方法:40只新西兰白兔随机分为对照组、假手术组、脓毒血症模型组、脓毒血症模型Na HS处理组和脓毒血症模型Na HS联合TAK-242(TLR4抑制剂)处理组,每组8只。各组分别按分组处理72 h后,采用HE染色观察兔肾组织病理学变化;使用全自动生化分析仪检测血尿素氮(BUN)和血清肌酐(SCr)水平;采用ELISA法检测血液中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、肾损伤分子1(KIM-1)、降钙素原(PCT)以及炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的水平;采用Western blot检测TLR4/MyD88/PI3K信号通路相关蛋白的表达。结果:与对照组相比,脓毒血症兔肾组织呈现明显损伤,Na HS处理后肾脏病理明显改善,且血液中BUN、SCr、NGAL、KIM-1、PCT、IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著提高(P <0.05),但Na HS处理或联合TAK-242处理后显著降低;脓毒血症兔肾脏组织中的TLR4、MyD88、p-PI3K和p-Akt蛋白水平显著升高;Na HS处理或抑制TLR4则显著抑制TLR4/MyD88/PI3K信号通路激活。结论:H_2S可能通过抑制TLR4/MyD88/PI3K信号通路减少炎症因子及肾损伤因子的释放,从而有效减轻尿源性脓毒血症诱导的急性肾损伤。

连草泻痢胶囊对溃疡性结肠炎小鼠模型肠黏膜炎症因子及TLR4/PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响

目的:观察连草泻痢胶囊对溃疡性结肠炎(UC)小鼠模型肠道黏膜炎症因子及TLR4/PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响。方法:40只雄性C57BL/6小鼠随机分为空白组、模型组、连草泻痢组和美沙拉嗪组,每组10只。除空白组外,余下3组小鼠采用3%葡聚糖硫酸钠诱导诱导急性UC小鼠模型,造模期间各组给予相应的药物及生理盐水灌胃治疗。实验结束后通过HE染色观察各组小鼠结肠组织病理形态的改变,ELISA法检测血清及结肠组织中炎症因子(TNF⁃α、IL⁃6、IL⁃1β、IL⁃8、IL⁃17和INF⁃γ)的含量,Western blot法检测TLR4/PI3K/Akt/mTOR信号通路中相关蛋白的表达水平。结果:与模型组相比,连草泻痢胶囊能明显增加UC小鼠结肠长度和降低结肠组织病理学评分,差异具有统计学意义(P<0.01)。此外,与模型组相比,连草泻痢组血清及结肠组织中炎性因子TNF⁃α、IL⁃6、IL⁃1β、IL⁃8、IL⁃17和INF⁃γ的含量均明显减少,TLR4、PI3K、p⁃Akt和p⁃mTOR蛋白的表达明显下调,差异均具有统计学意义(P<0.01);而连草泻痢胶囊及美沙拉嗪对结肠组织中Akt和mTOR蛋白的表达水平无明显影响,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:连草泻痢胶囊通过抑制TLR4/PI3K/Akt/mTOR信号通路的活化,降低炎症因子的分泌,改善UC肠道黏膜损伤和炎症反应。

栝楼桂枝汤调控TLR3通路对小胶质细胞活化诱导的神经细胞损伤的保护作用研究

目的:探讨栝楼桂枝汤通过TLR3(toll-like receptor 3)信号通路抑制小胶质细胞活化介导的炎症反应发挥神经细胞保护作用的分子机制。方法:栝楼桂枝汤预处理后,分别使用脂多糖刺激BV2细胞建立炎症模型和BV2细胞的条件性培养基(microglia-conditioned media, MCM)干预HT22细胞制备神经细胞损伤模型。CCK-8(cell counting kit-8)法测定细胞活力;ELISA法检测细胞培养上清中的细胞因子;通过免疫荧光实验检测TLR3及TRIF(toll/interleukin receptor domain-containing adaptor-inducing IFNβ)蛋白的表达情况;采用DNA-binding ELISA法检测转录因子IRF3(interferon regulatory factor 3)的活化水平;细胞TLR3 siRNA(small interfering RNA)转染实验验证栝楼桂枝汤的作用靶点;采用Western blot法检测凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表达水平;采用Caspase-9活性测定法测定其活性。结果:栝楼桂枝汤可显著减轻MCM诱导的HT22细胞损伤,并上调脂多糖刺激的BV2细胞上清中IFN-β的含量,下调IL-8的含量。同时,栝楼桂枝汤显著增加TLR3通路相关蛋白的表达水平并促进IRF3的活化水平,且敲低TLR3表达后,栝楼桂枝汤对抗炎因子IL10无促进作用。此外,栝楼桂枝汤可使经MCM干预后HT22细胞的Bcl-2表达增加,Bax表达下降,Caspase-9活性降低。结论:栝楼桂枝汤可能通过激活TLR3信号通路调节小胶质细胞活化后的炎症反应,抑制神经细胞凋亡,进而缓解神经细胞损伤。

低氧通过激活PTEN介导的TLR4/NF-κB/NLRP3通路影响氧化应激、运动HRV及神经内分泌的机制研究

目的:分析20~40岁青年男性运动心率变异与神经内分泌、氧化应激指标的关联性,并探讨PTEN介导的TLR4/NF-κB/NLRP3通路影响高原氧化应激、运动HRV及神经内分泌的机制。方法:以109名世居帕米尔高原高寒地区及113名世居平原20~40岁青年男性为受试者,定量负荷运动后采集HRV时域及频域数据,RIA法及试剂盒法测定血清热休克蛋白(HSP-70)、5-羟色胺(5-HT)、甲肾上腺素(NE)、谷胱甘肽(GSH-px)、一氧化氮(NO)、活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、皮质醇(COR)和促肾上腺皮质激素(ACTH)浓度,Western-Bolt检测受试者PTEN及TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路相关蛋白表达。结果:随年龄上升,世居高原及世居平原受试者血清HSP-70水平呈现上升趋势,血清NE、5-HT、COR及ACTH呈下降趋势;血清GSH-px、ROS及MDA水平随年龄增长呈上升趋势,血清NO及SOD呈下降趋势;心率变异时域及频域指标随年龄增长呈现下降趋势。关联性分析结果表明,世居高原及平原20~25岁组、26~30岁组及36~40岁组受试者运动后RMSSD与ROS存在显著关联(P<0.05),31~35岁组受试者运动后RMSSD与ROS不存在显著关联(P>0.05);各年龄组受试者血清HSP-70与血清ROS均存在显著关联(P<0.05);各年龄组受试者血清HSP-70与运动后RMSSD均存在显著负性关联(P<0.05)。随年龄增长,受试者PTEN及p-PTEN蛋白表达呈下降趋势,TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路相关蛋白及其磷酸化水平均呈上升趋势。与平原对照组比较,高原低氧能够显著上调受试者血清PTEN蛋白表达并提高其磷酸化水平,同时显著上调TLR4、NF-κB蛋白表达水平。结论:世居高原及平原受试者氧化应激、神经内分泌及运动心率变异存在增龄性特征,PTEN介导的TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路在上述指标的低氧耐受及增龄性发展中发挥作用。

绿原酸通过调节TLR3-TRIF通路抑制小胶质细胞炎性反应的机制研究

目的:研究绿原酸(chlorogenic acid,CGA)在单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus-1,HSV-1)感染的BV2小胶质细胞中的抗炎作用。方法:把不同浓度梯度的CGA加入到正常BV2细胞中,通过CCK-8试剂盒测定CGA最大无毒浓度范围,以HSV-1感染BV2细胞建立HSV-1细胞模型,然后用不同浓度梯度的CGA进行处理,通过Real-time PCR检测Toll样受体(toll-like receptor 3,TLR3)信号通路中β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TIRdomain-containing adaptor inducing interferon-β,TRIF)mRNA的表达,Western blot检测TLR3、TRIF的蛋白表达情况,ELISA检测炎性因子组织细胞内干扰素α(interferon-α,IFN-α)水平。结果:单纯疱疹病毒性脑炎细胞模型中TLR3及其下游分子TRIF的mRNA、蛋白表达及IFN-α水平均明显高于正常对照组(P<0.05);而绿原酸干预可有效抑制炎性反应,TLR3及其下游分子TRIF的mRNA、蛋白表达及IFN-α水平均明显降低。结论:绿原酸能明显抑制小胶质细胞内TLR3通路,降低HSV-1引起的炎性反应。

基于TLR4/NLRP3通路探讨葛黄颗粒含药血清对乙醇诱导的L-02肝细胞损伤的保护作用及机制研究

目的探讨葛黄颗粒含药血清对乙醇诱导的L-02肝细胞损伤的影响及其可能机制。方法SD雄性大鼠45只,随机分为三组(15只/组):空白对照组、葛黄颗粒组及美他多辛组。空白对照组予以蒸馏水灌胃、葛黄颗粒组(3.1 g·100 g^(-1)·d^(-1))、美他多辛组(0.1 g·100 g^(-1)·d^(-1))灌胃,连续干预5天,腹主动脉取血制备含药血清。将L-02肝细胞分为六组并按以下方式干预:正常组(加入10%正常大鼠血清)、模型组(在正常组基础上加入3%乙醇)、葛黄颗粒高、中、低剂量组(分别加入不同浓度葛黄颗粒含药血清及正常大鼠血清及3%乙醇)、美他多辛组(加入3%乙醇、美他多辛及正常大鼠血清各5%),将L-02肝细胞培养24 h后进行之后实验部分。ELISA法检测NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-18水平;RT-PCR法检测NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA的表达;Western blot法检测TLR4、NLRP3、ASC、Caspase-1的蛋白表达。结果与正常组比较:模型组NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-18明显升高,NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA表达明显升高,TLR4、NLRP3、ASC、Caspase-1的蛋白表达均亦明显升高(P<0.05);与模型组相比较:以上指标在葛黄颗粒高、中剂量组及美他多辛组表达水平均有所降低(P<0.05);与美他多辛组比较:葛黄颗粒高剂量组中TNF-α、IL-18有统计学意义(P<0.05),而IL-1β、NF-KB差异则不显著(P>0.05);葛黄颗粒低剂量组中NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA差异显著(P<0.05),而在高、中剂量组差异则均无统计学意义(P>0.05);TLR4、NLRP3、ASC、Caspase-1的蛋白表达水平在葛黄颗粒各剂量组均有统计学意义(P<0.05)。结论葛黄颗粒含药血清可能通过TLR4/NLRP3信号通路改善乙醇诱导的肝细胞炎症损伤。