基于TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路探讨黄连解毒汤对冠状动脉性心脏病小鼠心肌保护作用

目的 研究基于Toll样受体4(TLR4)/核转录因子-κB(NF-κB)/NOD样受体蛋白3(NLRP3)信号通路探讨黄连解毒汤对冠状动脉粥样硬化性心脏病(CHD)小鼠心肌保护作用。方法 50只6周的雄性SD小鼠中取10只作正常对照组,其余小鼠给予高脂饮食建立CHD模型。采用随机数字表法将40只模型小鼠分为模型组、黄连解毒汤低、中、高剂量组,每组各10只。黄连解毒汤低、中、高剂量组每日分别以10、20、40 g/kg剂量进行灌胃,每日1次,持续6周;正常组、模型组每日给予等量蒸馏水灌胃。干预后采用生化法检测各组总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)水平,酶联免疫吸附试验检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛、内皮素水平;采用苏木精-伊红染色法观察小鼠心肌细胞病理形态,蛋白质印迹法检测心肌组织中TLR4、NF-κB、NLRP3的表达。比较各组小鼠血脂、心肌组织中抗氧化相关指标和TLR4、NF-κB、NLRP3的表达。结果 模型组、黄连解毒汤低、中、高剂量组血脂水平均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);黄连解毒汤低剂量组与模型组血脂水平比较,差异无统计学意义(P>0.05);黄连解毒汤中、高剂量组总胆固醇、甘油三酯、LDL水平均低于模型组,HDL水平高于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。模型组、黄连解毒汤低、中、高剂量组心肌组织中SOD水平均低于对照组,丙二醛、内皮素水平均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);黄连解毒汤低、中、高剂量组SOD水平均高于模型组,丙二醛、内皮素水平均低于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。对照组心肌纤维排列整齐,横纹清晰且细胞完整,无细胞肿胀、炎症浸润等;模型组心肌纤维排列紊乱,结构发生异常,有严重细胞肿胀、炎症浸润;黄连解毒汤低、中、高剂量组未见心肌纤维断裂,黄连解毒汤中、高剂量组细胞肿胀和炎症浸润情况优于黄连解毒汤低剂量组,黄连解毒汤高剂量组优于黄连解毒汤中剂量组。模型组、黄连解毒汤中、高剂量组TLR4、NF-κB、NLRP3蛋白表达量均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);黄连解毒汤低、中、高剂量组TLR4、NF-κB、NLRP3蛋白表达量均低于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。且黄连解毒汤各剂量组中以上指标变化呈剂量依赖性。结论 黄连解毒汤能降低CHD小鼠血脂水平,保护心肌细胞,其能够通过下调组织TLR4、NF-κB、NLRP3蛋白表达以调节血脂水平并改善心肌功能,且黄连解毒汤的效果随着剂量的增加而增强。

宣肺败毒方调控TLR4/NLRP3/Caspase1信号通路抗小鼠急性肺损伤的作用机制研究

[目的]基于Toll样受体4(TLR4)/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)/半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase1)信号通路研究宣肺败毒方(XFBD)对IgG免疫复合物(IgG-IC)诱导小鼠急性肺损伤(ALI)的药效作用及机制研究。[方法]采用IgG-IC诱导小鼠构建ALI模型,灌胃XFBD 4 g生药/kg和8 g生药/kg,单次给药;苏木素-伊红染色法(HE)观察肺组织病理变化;乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒测定细胞活力;荧光定量PCR法检测小鼠肺组织细胞因子白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-18(IL-18)、白细胞介素-1β(IL-1β)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)以及TLR4/NLRP3/Caspase1信号通路相关因子mRNA表达量;免疫组化法检测小鼠肺组织TLR4、NLRP3和消皮素D(GSDMD)蛋白表达;蛋白免疫印迹法检测小鼠肺组织闭合蛋白(Occludin)、闭锁连接蛋白1(ZO-1)以及TLR4/NLRP3/Caspase1信号通路相关因子蛋白表达水平。[结果]与正常组相比,模型组小鼠肺组织炎性细胞浸润,肺泡间隙增厚,肺组织病理损伤评分和肺组织脏器系数显著升高,LDH及细胞因子表达明显升高,Occludin和ZO-1表达下调,TLR4/NLRP3/Caspase1信号通路相关因子mRNA和蛋白水平显著升高;与模型组相比,XFBD显著缓解急性肺损伤小鼠肺组织炎症细胞浸润,降低细胞因子表达,上调Occludin和ZO-1,显著下调TLR4/NLRP3/Caspase1信号通路相关因子mRNA和蛋白水平。[结论]XFBD可通过调控TLR4/NLRP3/Caspase1信号通路发挥抗小鼠ALI的作用。

基于TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路探讨柴胡皂苷B2对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的影响

目的探讨柴胡皂苷B2对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的影响。方法大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、依那普利(10 mg/kg)组和柴胡皂苷B2低、中、高剂量组(5、10、20 mg/kg),每组12只。除假手术组外,其余5组建立单侧输尿管梗阻(UUO)模型,各组灌胃给予相应药物,每天1次,连续给药2周。全自动生化分析仪检测大鼠血清中血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)水平,ELISA法检测大鼠血清TNF-α、IL-1β水平,Masson染色观察大鼠肾组织病理学变化,试剂盒检测大鼠肾组织中肾上腺髓质素(ADM)水平,免疫组化法检测大鼠肾组织中E-钙黏蛋白(E-cadherin)、转化生长因子-β1(TGF-β1)阳性表达,Western blot法检测大鼠肾组织中TLR4、NF-κB、p-NF-κB、NLRP3蛋白表达。结果与假手术组比较,模型组大鼠肾组织可见肾小管扩张,上皮细胞出现部分空泡化,肾间质内大量炎性细胞浸润、纤维细胞生成及胶原纤维沉积,血清BUN、Scr、TNF-α、IL-1β水平、肾组织TGF-β1阳性表达、TLR4、p-NF-κB/NF-κB、NLRP3蛋白表达升高(P<0.05),肾组织ADM水平、E-cadherin阳性表达降低(P<0.05);与模型组比较,柴胡皂苷B2各剂量组大鼠肾脏病变逐渐减轻,血清BUN、Scr、TNF-α、IL-1β水平,肾组织TGF-β1阳性表达,TLR4、p-NF-κB/NF-κB、NLRP3蛋白表达均降低(P<0.05),肾组织ADM水平、E-cadherin阳性表达均升高(P<0.05);与柴胡皂苷B2高剂量组比较,依那普利组上述指标无明显变化(P>0.05)。结论柴胡皂苷B2能够缓解UUO大鼠肾间质纤维化,改善肾功能和炎症反应,可能与抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路的表达有关。

TLR4/miR-223/NLRP3信号通路的表达与脑卒中后抑郁大鼠海马炎症反应的关系

目的探究Toll样受体4(TLR4)/miR-223/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)信号通路的表达与脑卒中后抑郁(PSD)大鼠海马炎症反应的关系。方法30只3月龄SPF级健康雄性Sprague-Dawley大鼠分为假手术组,PSD模型组和TLR4抑制剂组,各10只。PSD模型组和TLR4抑制剂组建立PSD模型,TLR4抑制剂组给予0.3 mg/kg的TAK-242溶液腹腔注射,其余各组均腹腔注射等体积的生理盐水溶液,5次/周,连续4周。评定各组大鼠的神经行为学,ELISA法检测血清白介素-1β(IL-1β)和IL-10的表达水平,RT-PCR测定海马组织中TLR4/miR-223/NLRP3信号通路相关基因的表达,Western blot测定TLR4/miR-223/NLRP3信号轴蛋白的相对表达。结果与假手术组相比,PSD模型组和TLR4抑制剂组大鼠Longa评分以及血清IL-1β和IL-10的表达升高,糖水偏嗜比(SP)、移动情况(LA)显著降低(P<0.05);与PSD模型组相比,TLR4抑制剂组大鼠Longa评分以及血清IL-1β和IL-10的表达表达下降、LA和SP升高(P<0.05)。与假手术组相比,PSD模型组大鼠海马组织中TLR4 mRNA、miR-223和NLRP3 mRNA以及TLR4、NLRP3、IL-1β和IL-10蛋白的相对表达均显著升高(P<0.05);与PSD模型组相比,TLR4抑制剂组的TLR4 mRNA和NLRP3 mRNA以及TLR4、NLRP3、IL-1β和IL-10蛋白的相对表达显著降低,miR-223的表达显著升高(P<0.05)。结论TLR4/miR-223/NLRP3信号转导通路与PSD海马炎症反应密切相关,通过调控TLR4/miR-223/NLRP3信号转导通路可能成为临床防治PSD的新靶位和新思路。

芪苈强心胶囊联合沙库巴曲缬沙坦钠对老年慢性心力衰竭患者血清Gal-3、Copeptin水平及TLR4/NF-κB信号通路的影响

目的:探讨芪苈强心胶囊辅助治疗老年CHF对患者Gal-3、Copeptin水平及TLR4/NF-κB信号通路的影响。方法:采用随机数表法将2021年3月至2023年3月平顶山市第一人民医院112例老年CHF患者分为采用沙库巴曲缬沙坦钠(诺欣妥)治疗的常规组(n=56例)和采用芪苈强心胶囊辅助治疗的联合组(n=56例)。观察两组疗效、心功能、血清半乳糖凝集素-3(Gal-3)、Copeptin水平、Toll样受体(TLR4)、核因子-κ(NF-κB)水平及不良反应。结果:治疗3个月后,联合组的临床治疗总有效率、心输出量(CO)、左心室射血分数(LVEF)高于常规组(P<0.05);联合组TLR4、NF-κB、Gal-3、Copeptin水平低于常规组(P<0.05);两组患者用药期间不良反应发生率对比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:芪苈强心胶囊联合沙库巴曲缬沙坦钠可调节TLR4、NF-κB水平,促进老年CHF患者心功能恢复,并抑制心肌重构,进而有效提高临床治疗疗效,且不增加患者不良反应发生风险。

乔松素抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路对急性心肌梗死大鼠炎症损伤的影响

目的:探讨乔松素调控TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路对急性心肌梗死(AMI)大鼠炎症损伤的影响。方法:采用冠状动脉结扎法复制AMI模型,将大鼠分为Sham组、AMI组、Pinocembrin组(5 mg/kg尾静脉注射)、TLR4抑制剂组(TAK-242组,2.0 mg/kg尾静脉注射),检测大鼠心功能指标(LVEF、LVEDD、LVESD、FS)及血清LDH、cTnⅠ、IL-6、IL-β、TNF-α水平,TTC染色、HE染色与Masson染色观察大鼠心肌梗死及心肌组织病理学变化,TUNEL法检测心肌细胞凋亡,免疫组化及Western blot检测大鼠心肌组织TLR4/NF-κB/NLRP3通路相关蛋白。结果:与Sham组比较,AMI组大鼠心肌梗死面积增加,心肌细胞数量减少,部分心肌纤维断裂,炎症细胞浸润,胶原纤维增加,细胞凋亡率显著升高(P<0.05),LVEDD、LVESD、血清LDH、cTnⅠ、IL-6、IL-β、TNF-α水平、心肌组织TLR4、MyD88、p-NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1表达水平显著升高(P<0.05),LVEF、FS显著降低(P<0.05);与AMI组比较,Pinocembrin组与TAK-242组大鼠心肌梗死面积减少,细胞损伤及炎症浸润减轻,坏死细胞明显减少,细胞凋亡率显著降低(P<0.05),LVEDD、LVESD、血清LDH、cTnⅠ、IL-6、IL-β、TNF-α水平、心肌组织TLR4、MyD88、p-NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1表达水平降低(P<0.05),LVEF、FS显著升高(P<0.05);Pinocembrin组与TAK-242组大鼠各指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论:乔松素可能通过抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路减轻AMI引起的心肌炎症损伤。

积雪草酸通过调控TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路改善非酒精性脂肪肝的机制研究

探究天然活性成分积雪草酸(asiatic acid,AA)对高脂饮食导致的非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的改善作用及机制。取雄性C57BL/6J小鼠40只,分为正常组、模型组、AA低剂量组、AA高剂量组,高脂饮食4周后给予AA干预,持续12周;实验结束后,称量肝脏重量并计算肝脏指数;通过分光光度法测定小鼠血清中脂肪肝相关生化指标的含量;通过酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法检测小鼠血清中相关炎症因子的表达水平;通过免疫印记法检测小鼠肝脏中TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路相关蛋白的表达;通过多种染色法观察小鼠肝脏病理学变化。结果显示:AA可以有效改善NAFLD小鼠的一般指标,生化指标、炎症因子及TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路相关蛋白的表达。AA可以通过下调TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路,抑制肝脏炎症,改善NAFLD。

三硝基苯磺酸/乙醇灌肠液诱导大鼠溃疡性结肠炎TLR4/NF-κB和PI3K/AKT/NF-κB信号通路的表达及电针的干预作用

目的探讨三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇灌肠液诱导大鼠溃疡性结肠炎TLR4/NF-κB和PI3K/AKT/NF-κB信号通路的表达及电针的干预作用。方法雄性Wistar大鼠240只,随机分为正常对照组、模型组、电针组、TLR4单克隆抗体(TLR4mAb)组、LY294002组和TLR4mAb-LY294002联合治疗(T&L)组。以TNBS/乙醇溶液灌肠诱导大鼠溃疡性结肠炎模型,电针组造模同时给予电针足三里穴治疗,TLR4mAb组给予TLR4mAb腹腔注射,LY294002组则予LY294002注射液腹腔注射,T&L组则同时给与上述TLR4mAb和LY294002腹腔注射,共4周,每日行疾病活动指数(DAI)评分。造模4周后处死大鼠取结肠组织标本,评价结肠黏膜损伤指数(CMDI)和组织学损伤指数(TDI);免疫印迹法测定结肠黏膜磷酸化AKT(P-AKT)和活化NF-κB含量;RT-PCR法检测结肠组织中TLR4mRNA、PI3K mRNA、AKT mRNA、NF-κB mRNA、TNF-αmRNA及IL-1βmRNA表达。结果与正常对照组比较,模型组结肠组织TLR4mRNA、PI3K mRNA、P-AKT、活化NF-κB、TNF-αmRNA、IL-1βmRNA表达和DAI、CMDI及TDI均显著升高(P<0.01);与模型组比较,TLR4mAb组TLR4mRNA表达显著下降(P<0.01),LY294002组PI3K mRNA、P-AKT表达显著下降(P<0.01),而在电针组和T&L组TLR4mRNA、PI3K mRNA及P-AKT表达均明显降低(P<0.01);与上述变化相对应,与模型组相比,各治疗组活化NF-κB、TNF-αmRNA、IL-1βmRNA表达和DAI、CMDI及TDI均明显降低(P<0.05或P<0.01),电针组和T&L组上述6指标优于TLR4mAb组和LY294002组,活化NF-κB与TNF-αmRNA及IL-1βmRNA表达呈正相关(r1=0.579,P<0.05;r2=0.561,P<0.05)。结论电针足三里穴能显著降低实验性溃疡性结肠炎大鼠的NF-κB活性及TNF-αmRNA、IL-1βmRNA表达,从而减轻结肠组织损害程度,这与其阻断TLR4/NF-κB和PI3K/AKT/NF-κB信号通路有密切关系。

TLR_4/P38/JNK信号通路在海马神经元凋亡中的作用

目的:探讨Toll样受体4(TLR4)/P38/JNK信号通路在海马神经元凋亡中的作用及其机制,为神经退行性疾病(ND)的发病机制与防治研究提供新的实验依据。方法:采用体外培养7 d的新生大鼠海马神经元,免疫荧光双标法鉴定海马神经元纯度。用TLR4配体脂多糖(LPS)或TLR4抗体预处理海马神经元,以激活或阻断TLR4的作用。实验1设正常对照组、LPS组及TLR4抗体+LPS组;免疫荧光法检测P-P38,P-JNK的表达。实验2分为6组:正常对照组,LPS组,TLR4抗体+LPS组,SB202190(抑制P38)+LPS组,SP600125(抑制JNK)+LPS组,PD98059(抑制ERK)+LPS组;分别用TLR4抗体、P38、JNK及ERK的抑制剂预处理海马神经元后再给以LPS刺激24 h,Western blot法检测Bcl-2,Bax,Active-caspase-3的表达变化;流式细胞术检测海马神经元凋亡率。结果:LPS组海马神经元P-P38、P-JNK的表达明显高于正常对照组(P<0.01),TLR4抗体+LPS组P-P38,P-JNK表达显著低于LPS组(P<0.01)。与正常对照组相比,LPS组海马神经元Bcl-2/Bax表达减少、Active-caspase-3表达增加,海马神经元凋亡率增加(P<0.01)。而TLR4抗体+LPS组、SB202190+LPS组、SP600125+LPS组Bcl-2/Bax显著高于LPS组、Active caspase-3显著低于LPS组(P<0.01),海马神经元凋亡率显著低于LPS组(P<0.05,P<0.01)。PD98059+LPS组与LPS组海马神经元凋亡率无明显差异。结论:1海马神经元中有TLR4介导的P38/JNK信号通路。2海马神经元TLR4激活后,P-P38、P-JNK表达增加,使Bcl-2/Bax的比例降低和Active-caspase-3表达增加,从而促进海马神经元的凋亡。海马神经元凋亡过程中有TLR4介导的P38/JNK信号通路的参与。

白藜芦醇在PD小鼠模型中对TLR3/TRIF信号通路及脑内炎症微环境的影响

目的建立1-甲基-4苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的小鼠PD模型,探究白藜芦醇(resveratrol,Res)对PD小鼠TLR3/TRIF信号通路及中脑黑质炎症微环境的影响。方法雄性C57/BL6小鼠30只,按照随机数字表法分为对照组、MPTP组和MPTP+Res组,每组各10只。对照组腹腔注射相同体积生理盐水;MPTP组腹腔注射生理盐水新鲜配制的MPTP 30mg/(kg·d),连续7d,结束注射7d后取材;MPTP+Res组:Res用乙醇溶解为50mg/mL,用PBS以1∶4的体积比进行稀释,连续注射MPTP 7d后,腹腔注射Res 28d,结束注射7d后取材。采用免疫组化及免疫荧光分别观察小鼠中脑黑质中多巴胺能神经元的变化及小胶质细胞、星形胶质细胞的活化状态。采用实时荧光定量PCR技术检测中脑黑质相关炎症因子mRNA的表达。结果免疫组化结果显示:与MPTP组相比,MPTP+Res组小鼠中脑黑质TH标记的多巴胺能神经元的数量及形态未发生明显变化;CD11b标记的小胶质细胞胞体相对变小,呈圆形及椭圆形,突起减少,变细、变长;而GFAP标记的星形胶质细胞胞体变小,胞体呈圆形,突起变短。qPCR实验结果表明:与MPTP组相比,MPTP+Res组小鼠中脑黑质部位TLR3、IFN-β的mRNA表达量明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),但TRIF的mRNA表达量未见明显变化,促炎因子iNOS、TNF-α的mRNA表达量明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。而抗炎因子Arg^(-1)的mRNA表达量明显增加。结论 Res可能通过抑制小胶质细胞及星形胶质细胞活化及激活TLR3/TRIF信号通路,降低中脑黑质的促炎因子的释放,从而改善MPTP诱导的小鼠PD模型中的炎症微环境。

人参皂苷Rb1介导TLR3/TRIF信号通路对哮喘大鼠的抗炎作用机制

目的探讨人参皂苷Rb1介导Toll样受体(TLR)3/β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TRIF)信号通路对哮喘大鼠模型抗炎作用的影响。方法80只SD大鼠随机分成5组:对照组、模型组、地塞米松组(1 mg/kg)、人参皂苷Rb1低剂量组(100 mg/kg)、人参皂苷Rb1高剂量组(200 mg/kg),每组16只。模型组、地塞米松组、人参皂苷Rb1低、高剂量组建立哮喘大鼠模型,建模成功后地塞米松组、人参皂苷Rb1低、高剂量组给予相应药物灌胃,对照组及模型组给予等量的生理盐水灌胃,每天1次,连续给药14 d。末次给药后24 h,测定大鼠血液淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、动脉血氧分压(PaO_(2))水平,计算大鼠肺/体比值,苏木素-伊红(HE)染色观察肺组织病理学变化,实时荧光定量PCR及蛋白免疫印迹法测定大鼠肺组织中TLR3、TRIF mRNA和蛋白表达水平。结果与对照组比较,模型组大鼠肺/体比值、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞水平、TLR3、TRIF mRNA和蛋白表达水平明显升高,PaO_(2)水平明显降低(P<0.05);与模型组比较,地塞米松组、人参皂苷Rb1低、高剂量组大鼠肺/体比值、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞水平、TLR3、TRIF mRNA和蛋白表达水平降低,PaO_(2)水平升高(P<0.05);且人参皂苷Rb1高剂量组大鼠肺/体比值、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞水平、TLR3、TRIF mRNA和蛋白表达水平低于人参皂苷Rb1低剂量组,PaO_(2)水平高于人参皂苷Rb1低剂量组(P<0.05);与地塞米松组比较,人参皂苷Rb1低剂量组大鼠肺/体比值、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞水平、TLR3、TRIF mRNA和蛋白表达升高,PaO_(2)水平降低(P<0.05);人参皂苷Rb1高剂量组与地塞米松组上述指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论人参皂苷Rb1能够减轻哮喘模型大鼠肺部炎症反应,其机制可能与人参皂苷Rb1抑制哮喘大鼠肺部TLR3、TRIF mRNA和蛋白表达水平进而抑制TLR3/TRIF信号通路的激活有关。

疏风宣肺方和解表清里方对流感病毒H1N1感染人肺腺癌上皮细胞A549中TLR3/7信号通路作用的研究

目的:研究疏风宣肺方和解表清里方体外对人肺腺癌上皮细胞A549中TLR3/7信号通路的影响。方法:利用基因芯片技术研究甲型流感病毒H1N1感染A549细胞后TLR3/7信号通路中基因转录的变化。采用荧光定量PCR和Western blotting法检测各组细胞中的Toll样受体3(Toll-like receptor3,TLR3)、Toll样受体7(Toll-like receptor 7,TLR7)、髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,My D88)、激活核因子Kappa B(nuclear factor-Kappa B,NF-κB)的mRNA及蛋白表达的变化。结果:在TLR3/7相关信号传导通路中,与细胞对照组相比,H1N1感染组差异表达基因Tlr3、Tlr7、Myd88、Nfbk1、Mapk8、Mapk13、Ifna1、Ifnβ1明显上调,奥司他韦组、疏风宣肺组和解表清里组对差异表达基因Tlr3、Tlr7、Myd88、Nfbk1、Mapk8、Mapk13、Ifna1、Ifnβ1明显下调。qRT-PCR结果显示,与细胞对照组比较,H1N1感染组TLR3/7、My D88、NF-κB的mRNA表达均显著升高(P<0.01)。与H1N1感染组比较,疏风宣肺组的TLR3/7、My D88、NF-κB的mRNA表达均明显降低(P<0.05或P<0.01),解表清里方对TLR3/7、NF-κB的mRNA表达均明显降低(P<0.05或P<0.01)。同时,疏风宣肺组治疗效果优于解表清里组。Western blotting结果显示,H1N1感染组TLR3/7、NF-κB蛋白较正常组显著升高(P<0.05)。与H1N1感染组比较,两种方药的TLR3/7、NF-κB表达均显著降低(P<0.05或P<0.01)。结论:疏风宣肺方和解表清里方可以抑制流感病毒H1N1所诱导的TLR3/7信号通路活化,下调活性NF-κB的转录活性,发挥抗流感病毒的作用。

白虎加桂枝汤对急性痛风性关节炎大鼠TLRs和NALP3信号通路的影响

目的分析白虎加桂枝汤对急性痛风性关节炎(acute gouty arthritis,AGA)大鼠TLRs和NALP3信号通路的影响。方法于SD大鼠右侧踝关节处注入200μL尿酸钠溶液以构建AGA模型,本研究中最终成功构建40只AGA大鼠模型。将造模成功的大鼠随机分为模型组、低剂量组(0.265 g/100 g)、中剂量组(0.53 g/100 g)、高剂量组(1.06 g/100 g),每组各10只,并纳入10只健康SD大鼠为对照组,低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠分别灌胃不同剂量的白虎加桂枝汤,模型组和对照组灌胃等体积生理盐水,各组均连续灌胃7 d,并标准饲养。比较各组大鼠不同时刻踝关节周长、尿酸、血肌酐、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平、步态评分和滑膜组织中NALP3、TLRs相关蛋白及其mRNA表达水平。结果灌胃1、3、7 d时对照组大鼠的踝关节周长、尿酸、血肌酐、IL-1β、TNF-α水平、步态评分最低,且呈现剂量反应(P<0.05)。灌胃1、3、7 d时对照组大鼠滑膜组织中NALP3、TLR3、TLR7蛋白表达及其mRNA表达最低,且呈现剂量反应(P<0.05)。结论白虎加桂枝汤能够改善AGA大鼠的炎症反应,改善肾功能,减轻踝关节组织病理损伤,其机制可能与抑制TLRs和NALP3信号通路相关。

姜黄素通过调控miR-29-3p和TLR4/NF-κB信号通路改善肾间质纤维化

为探究姜黄素通过调控miR-29-3p的表达和Toll样受体(TLR4)/核因子κB(NF-κB)信号通路发挥抗炎及抗纤维化的作用,通过转化生长因子β1(TGF-β1)诱导建立肾间质纤维化细胞模型,采用MTT法和流式细胞术分别测定姜黄素对细胞增殖活性和细胞凋亡率的影响,以酶联免疫吸附法(Elisa)和免疫印迹(WB)分别检测姜黄素和miR-29-3p mimic对人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2细胞)上清液肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)分泌水平的影响以及Ⅰ型胶原(COLⅠ)、Ⅲ型胶原(COLⅢ)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和NF-κB/TLR4信号通路相关蛋白的表达情况,用RT-PCR法检测miR-29-3、Ⅰ型胶原蛋白α1链(COL1A1)和Ⅲ型胶原蛋白α1链(COL3A1)的表达水平。研究结果表明,与模型组相比,当姜黄素浓度为10μmol/L时可显著抑制TGF-β1诱导的肾间质纤维化细胞过度增殖,提高其凋亡率(P<0.05),抑制α-SMA(P<0.05)、COLⅠ(P<0.01)、COLⅢ(P<0.05)的生成,促进miR-29-3p的表达(P<0.01),抑制IL-1β(P<0.01)、IL-6(P<0.01)和TNF-α(P<0.01)的产生和p-IκBα/IκBα(P<0.01)、TLR4(P<0.05)、p-P65/p65(P<0.05)蛋白的相对表达量;在细胞转染实验中,与模型组相比,转染miR-29-3p mimic后细胞上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著降低(P<0.01),细胞中COL1A1和COL3A1的mRNA和α-SMA、COLⅠ、COLⅢ、TLR4、p-IκBα/IκBα、p-P65/p65蛋白表达量显著下降(P<0.01)。研究表明,姜黄素具有抗炎和抗纤维化作用,能够改善肾间质纤维化,其机制与调控miR-29-3p和TLR4/NF-κB信号通路有关。

绿原酸通过调节TLR3-TRIF通路抑制小胶质细胞炎性反应的机制研究

目的:研究绿原酸(chlorogenic acid,CGA)在单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus-1,HSV-1)感染的BV2小胶质细胞中的抗炎作用。方法:把不同浓度梯度的CGA加入到正常BV2细胞中,通过CCK-8试剂盒测定CGA最大无毒浓度范围,以HSV-1感染BV2细胞建立HSV-1细胞模型,然后用不同浓度梯度的CGA进行处理,通过Real-time PCR检测Toll样受体(toll-like receptor 3,TLR3)信号通路中β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TIRdomain-containing adaptor inducing interferon-β,TRIF)mRNA的表达,Western blot检测TLR3、TRIF的蛋白表达情况,ELISA检测炎性因子组织细胞内干扰素α(interferon-α,IFN-α)水平。结果:单纯疱疹病毒性脑炎细胞模型中TLR3及其下游分子TRIF的mRNA、蛋白表达及IFN-α水平均明显高于正常对照组(P<0.05);而绿原酸干预可有效抑制炎性反应,TLR3及其下游分子TRIF的mRNA、蛋白表达及IFN-α水平均明显降低。结论:绿原酸能明显抑制小胶质细胞内TLR3通路,降低HSV-1引起的炎性反应。

miR-27a-3p介导TLR4/TRIF信号通路对脑出血大鼠神经的保护作用

目的分析miR-27a-3p介导Toll样受体(TLR)4/β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TRIF)信号通路对脑出血大鼠神经的保护作用。方法选取80只SD级雄性大鼠,20只作为正常组,其余60只建立大鼠脑出血模型后随机分为模型组、上调组、下调组各20只,做miR-27a-3p转染,鉴定miR-27a-3p转染率、脑组织中肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-1β含量、神经功能缺损情况、TLR4/TRIF信号通路蛋白表达情况。结果与模型组相比,上调组miR-27a-3p表达量升高,下调组miR-27a-3p表达量降低,具有统计学差异(P<0.05),证明miR-27a-3p转染成功。相比于正常组,模型组、上调组、下调组TNF-α、IL-1β含量、神经功能缺损评分、TLR4、TRIF、TRAM含量升高,具有统计学差异(P<0.05);相比于模型组,下调组TNF-α、IL-1β含量、神经功能缺损评分、TLR4、TRIF、TRAM含量升高,上调组TNF-α、IL-1β含量、神经功能缺损评分、TLR4、TRIF、TRAM含量降低,具有统计学差异(P<0.05);且下调组TNF-α、IL-1β含量、神经功能缺损评分、TLR4、TRIF、TRAM含量高于上调组,具有统计学差异(P<0.05)。结论miR-27a-3p可介导TLR4/TRIF信号通路对脑出血大鼠神经起到保护作用。减少大鼠脑内炎症反应。

绿原酸联合连翘苷调控细胞因子风暴的网络药理分析及基于TLR4/TRAF6/PI3KC3通路的协同抗炎作用

目的基于网络药理学和体外实验探究绿原酸联合连翘苷调控细胞因子风暴的机制。方法利用Swiss Target Prediction、PharmMapper、SEA和TCMSP数据库预测绿原酸和连翘苷的靶点,在GeneCards、OMIM、DRUGBANK和DisGeNET数据库获取细胞因子风暴的靶点,筛选交集靶点绘制Venn图,以STRING数据库和Cytoscape软件构建蛋白质相互作用网络,采用DAVID数据库进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析。以脂多糖(LPS)诱导RAW264.7巨噬细胞构建细胞因子风暴模型;采用细胞计数试剂-8(CCK-8)法检测巨噬细胞存活率;采用Griess法检测细胞上清液中一氧化氮(NO)含量;以酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧化酶-2(COX-2)的水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测TNF受体相关因子(TRAF4)、TNF受体相关因子6(TRAF6)、磷酸肌醇-3-激酶3(PIK3C3)蛋白表达。结果网络药理分析获得绿原酸联合连翘苷治疗细胞因子风暴的8个核心网络靶点[丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1)、白蛋白(ALB)、低氧诱导因子1α(HIF1A)、IL-6、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)、酪氨酸激酶(SRC)、Toll样受体4(TLR4)];富集关键通路包括PI3K/AKT信号通路等。体外实验结果显示,与对照组比较,模型组中NO、TNF-α、IL-6的释放量和iNOS、COX-2蛋白表达量均显著升高(P<0.001)。与模型组比较,给药后NO、TNF-α、IL-6、iNOS、COX-2的水平均显著降低(P<0.001)。与单药给药组比较,绿原酸和连翘苷(1∶1)联合用药组炎症指标下降更明显(P<0.001)。与模型组比较,给药组TLR4、TRAF6、PI3K3C的蛋白表达和PI3K3C的磷酸化水平显著下降。结论绿原酸联合连翘苷能协同抑制促炎细胞因子的表达,调控细胞因子风暴,可能通过TLR4/TRAF6/PI3K3C信号通路实现。

利用ICR小鼠模型对PCV2感染中TLR3信号通路的研究

为探究猪圆环病毒2型(PCV2)感染对TLR3信号通路及炎性细胞因子的影响,本研究将30只6周龄ICR雌鼠随机分成两组(感染组和对照组),腹腔接种PCV2b/YJ株,在接种后第7 d、14 d、21 d、28 d和35 d采集小鼠外周血及脾组织。以临床观察、脾组织PCV2基因拷贝、小鼠血清抗体效价、IL-10和TNF-α的mRNA水平等指标评估感染模型;荧光定量PCR检测小鼠脾组织TLR3、TRIF、IFN-β、Mx1的mRNA水平,western blot检测TLR3蛋白表达水平。结果显示:PCV2感染期间感染组小鼠无可见的临床症状,第7 d至35 d感染组小鼠脾组织PCV2基因拷贝数呈逐渐降低趋势,PCV2的IPMA血清抗体在感染后第7 d转阳、35 d达到最高,IL-10 mRNA在感染后第14 d起升高、维持高水平;TNF-αmRNA在感染后第21 d和28 d升高。在感染后第7 d和14 d感染组小鼠TLR3、TRIF mRNA和TLR3蛋白表达水平显著升高;IFN-βmRNA在感染后第7 d具有显著升高过程;Mx1 mRNA在感染后第14 d时有上调过程。本实验在建立PCV2b/YJ亚临床感染ICR小鼠模型的基础上,体内实验表明PCV2感染小鼠激活了TLR3信号通路。本研究为利用敲除小鼠模型阐明TLR3参与PCV2感染引发的免疫应答机制奠定了基础。

人参皂苷Rb1介导TLR3/TRIF信号通路对慢性哮喘大鼠模型的抗炎作用机制研究

探讨人参皂苷Rb1介导TLR3/TRIF信号通路对慢性哮喘大鼠模型的抗炎作用的影响。方法:100只Wistar大鼠随机分为5组:对照组(A组)、模型组(B组)、布地奈德组(C组)、人参皂苷Rb1低剂量组(D组)、人参皂苷Rb1高剂量组(E组)。建立慢性哮喘大鼠模型,于末次雾化激发后,采血测定淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞水平;随后取肺组织,HE染色,镜下阅片;RT-PCR方法测定肺TLR3、TRIF基因表达水平。结果:与B组比较,C组、D组和E组淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、TLR3、TRIF mRNA表达明显降低(P<0.05),且随着人参皂苷Rb1剂量的增加,淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、TLR3、TRIF mRNA逐渐降低(P<0.05);与C组比较,D组淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、TLR3、TRIF mRNA表达明显升高(P<0.05),但E组和C组比较无明显变化(P>0.05)。结论:人参皂苷Rb1能够降低慢性哮喘模型大鼠肺部炎症反应,其机制可能与人参皂苷Rb1抑制慢性哮喘大鼠肺部TLR3、TRIF mRNA表达水平进而抑制TLR3/TRIF信号通路的激活有关。

基于TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路探讨M1型巨噬细胞极化在肝硬化-肝性脑病发病中的研究进展

肝性脑病(HE)是失代偿期肝硬化患者一种严重的中枢神经系统并发症。而肝脏炎症反应则是肝性脑病患者病情恶化的重要原因,因此抑制肝脏炎症反应是治疗肝性脑病的有效途径之一。TLR4受体参与调节M1型巨噬细胞极化并促进炎症反应,NF-κB信号通路是参与炎症反应的重要通路,NLRP3炎症小体参与了巨噬细胞极化的过程。TLR4、NF-κB、NLRP3炎症小体三者组成了信号转导通路的上下游,TLR4可通过激活NF-κB/NLRP3炎症小体信号通路从而参与M1型巨噬细胞的极化。本文基于TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路探讨肝脏M1型巨噬细胞极化产生的炎症因子在HE中的作用,为临床提供更明确的诊疗证据。