人参皂苷Rg1通过TLR4/MyD88/NF-κB p65通路调控小鼠急性肾损伤诱导的急性肝损伤的机制研究

目的:探讨人参皂苷Rg1(GRg1)对小鼠急性肾损伤所诱导的急性肝损伤的保护作用及其调控机制。方法:昆明小鼠随机分为假手术(sham)组、模型(model)组、GRg1组和necrostatin-1 (Nec-1)组,每组10只。制备急性肾损伤模型,24 h后收集血液。采用生化试剂盒检测小鼠血清肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)、天冬氨酸转氨酶(AST)、谷氨酸转氨酶(ALT)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平。采用ELISA法检测炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达。HE染色观察组织病理学改变,采用免疫组织化学和Western blot法检测TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白的表达水平。结果:与假手术组比较,model组小鼠出现明显的肝细胞坏死、肝肾功能减退,血清中SCr、BUN、AST和ALT均显著升高(P<0.01),MDA含量显著上升,SOD活性显著降低(P<0.01),且血清中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α含量显著升高(P<0.01),TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白表达显著增高(P<0.01);与model组相比,GRg1和Nec-1组处理后小鼠肝细胞坏死减轻,肝肾功能显著改善(P<0.01),血清中SCr、BUN、AST和ALT水平显著降低(P<0.01),MDA含量显著降低,SOD活性显著增高(P<0.01),血清中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α含量显著降低(P<0.01),TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白表达显著降低(P<0.01);GRg1组和Nec-1组小鼠上述指标比较差异无统计学意义。结论:GRg1可以改善小鼠急性肾损伤所致急性肝损伤的肝肾功能,其机制可能与抑制TLR4/MyD88/NF-κB p65信号通路有关。

GPR120对脂多糖诱导的胰岛β细胞炎症损伤及TLR4/MyD88/NF-κB p65信号通路的影响

目的:探讨过表达G蛋白偶联受体120(GPR120)对脂多糖(LPS)诱导的胰岛β细胞炎症损伤及Toll样受体4(TLR4)/髓样分化因子(MyD88)/核转录因子-κB(NF-κB)信号通路的影响。方法:将MIN6细胞分为control组(细胞用无血清培养液进行培养)、LPS组(细胞用含10μg·ml^(-1) LPS的培养液进行培养)、LPS+control组(感染阴性对照慢病毒的细胞用10μg·ml^(-1) LPS培养液处理)、LPS+GPR120组(感染pcDNA3.1-GPR120慢病毒的细胞用10μg·ml^(-1) LPS培养液处理)4组。CCK-8法检测细胞增殖;Annexin-V-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡;ELISA检测IL-6、IL-1β和TNF-α水平;蛋白质印迹法检测GPR120、TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白的表达。结果:LPS组GPR120蛋白相对表达量明显低于control组(P<0.05);LPS+GPR120组GPR120蛋白相对表达量明显高于LPS+control组(P<0.05)。LPS组细胞增殖活力明显低于control组(P<0.001);LPS+GPR120组细胞增殖活力明显高于LPS+control组(P<0.001)。LPS组细胞凋亡率明显高于control组(P<0.001);LPS+GPR120组细胞凋亡率明显低于LPS+control组(P<0.001)。LPS组细胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均高于control组(均P<0.001);LPS+GPR120组IL-6、IL-1β和TNF-α水平均低于LPS+control组(均P<0.001)。LPS组细胞TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白相对表达量均高于control组(均P<0.001),LPS+GPR120组TLR4、MyD88、NF-κB p65相对表达量均低于LPS+control组(均P<0.001)。结论:GPR120可能通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB p65信号通路在LPS诱导的胰岛β细胞炎症损伤中发挥保护作用。

TLR2/4、MYD88和NF-κB P65在支原体肺炎小鼠中的表达及其相关性

目的对支原体肺炎小鼠中TLR2/4、MYD88和NF-κB P65的表达水平以及相关性进行研究分析。方法选取温州医科大学实验动物中心供给的健康成年雄性清洁级小鼠64只,按随机数字法进行分组,其中采用支原体菌液滴鼻建立的32只支原体肺炎小鼠作为观察组,采用生理盐水建立的32只正常小鼠作为对照组,对两组实验小鼠的肺组织病理变化情况、肺指数变化情况以及TLR2、TLR4、MYD88、NF-κB P65相关指标的密度值进行比较分析。结果观察组支原体肺炎感染小鼠肺指数、TLR2、TLR4表达水平明显高于对照组正常小鼠,差异有统计学意义(P<0.05);观察组感染小鼠MYD88、NF-KBP65、MYD88、NF-KBP65的表达水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。观察组小鼠中MYD88与TLR2均为阳性的18例,均为阴性的11例,与TLR4均为阳性的18例,均为阴性的10例,观察组支原体肺炎感染小鼠的MYD88的表达水平与TLR2、TLR4表达水平呈正相关关系,差异有统计学意义(P<0.05),小鼠MYD88的表达水平与NF-KBP65表达水平呈正相关关系,差异有统计学意义(P<0.05)。结论TLR2、TLR4、MYD88、NF-κB P65表达水平在支原体肺炎小鼠中升高,且参与到支原体感染的免疫损伤中。

双表法对流感病毒感染小鼠肺组织TLR4-MyD88-NF-κBP65蛋白表达的影响

目的观察双表法对流感病毒感染小鼠肺组织TLR4-MyD88-NF-κB P65蛋白表达的影响,探讨双表法对流感病毒的防治机制。方法以流感病毒FM1鼠肺适应株滴鼻感染昆明种小鼠,并用解表法(银翘散)、固表法(玉屏风散)、双表法(玉屏风+银翘散)、阳性对照药(利巴韦林)干预相应组别小鼠。在感染病毒后5d采用SABC免疫组织化学染色法检测肺组织TLR4-MyD88-NF-κB P65蛋白表达情况。结果正常组和模型组肺组织中均可检测到TLR4-MyD88-NF-κB P65蛋白表达,但模型组明显高于正常组(P<0.05)。双表法组TLR4-MyD88-NF-κB P65蛋白表达最低,与解表法组、固表法组、利巴韦林组比较有显著性差异(P<0.05)。结论流感病毒感染小鼠时激活了TLR4-MyD88-NF-κB P65信号通路,双表法能较好的抑制TLR4-MyD88-NF-κB P65蛋白表达,且优于解表法、固表法及利巴韦林。

热淋清颗粒对脓毒症急性肺损伤大鼠肺组织TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA及蛋白表达的影响

目的探讨热淋清颗粒对脓毒症急性肺损伤模型大鼠的保护作用及其机制。方法将30只SD大鼠随机分为6组:假手术组、模型组、热淋清颗粒高剂量组[4.8 g/(kg·d)]、热淋清颗粒中剂量组[2.4 g/(kg·d)]、热淋清颗粒低剂量组[1.2 g/(kg·d)]、阳性对照组[地塞米松1.5 mg/(kg·d)],每组5只。各组均采用灌胃给药,1次/d,连续给药7 d,末次给药后各组大鼠均采用盲肠结扎穿孔法制备脓毒症急性肺损伤模型(假手术组不结扎和穿孔),造模24 h后取材。取各组大鼠右肺中叶计算肺组织湿/干重比;采用HE染色法观察各组大鼠肺组织病理学改变并进行损伤评分;采用ELISA法检测各组大鼠血清中IL-1α、TNF-α、PGE2水平含量;采用RT-PCR法检测各组大鼠肺组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA相对表达量;采用Western-Blot检测各组大鼠肺组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白相对表达量。结果与假手术组比较,模型组大鼠肺组织湿/干重比、肺组织病理损伤评分显著升高(P<0.01);与模型组比较,热淋清颗粒高剂量组和阳性对照组可显著降低大鼠肺组织湿/干重比、肺组织病理损伤评分(P<0.05);与假手术组比较,模型组大鼠血清TNF-α、IL-1α、PGE2水平及肺组织TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA和蛋白表达量均显著升高(P<0.01);与模型组比较,热淋清颗粒高、中剂量组和阳性对照组大鼠血清TNF-α、IL-1α、PGE2水平及肺组织TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA和蛋白表达量显著降低(P<0.05);热淋清颗粒高剂量组上述各指标改善情况优于阳性对照组。结论热淋清颗粒能减轻脓毒症大鼠急性肺损伤,其机制可能与调节TLR4/MyD88/NF-κB p65通路有关。

栀子苷对缺氧/复氧小胶质细胞TLR4通路的影响

目的研究缺氧/复氧对原代培养的小胶质细胞TLR4受体及其通路中MyD88、NF-κBp65、p-ERK1/2、p-IκBα和p38的影响和不同浓度栀子苷的干预作用,以揭示栀子苷治疗脑缺血的分子生物学机制。方法原代培养小胶质细胞,采用缺氧/复氧的方式制备模型,用栀子苷125、250和500μmol.L-1 3个浓度梯度进行干预,用逆转录聚合酶链反应检测小胶质细胞TLR4 mRNA的表达,Western blot检测TLR4、p-IκBα、p38、p-ERK1/2蛋白,免疫荧光双染观察MyD88和NF-κB;结果缺氧/复氧激活了TLR4通路,并通过MyD88依赖途径激活了下游蛋白MyD88、NF-κBp65、p-ERK1/2、p-IκBα和p38;栀子苷250和500μmol.L-1组抑制了通路蛋白的活性;结论缺氧/复氧使TLR4通路蛋白磷酸化激活。栀子苷通过对TLR4通路蛋白的抑制发挥抗炎效应,促进脑缺血的恢复。

Therapeutic Effect and Mechanism of Jipei Dilong Ointment on Acute Soft Tissue Injury in Rats

[Objectives]This study was conducted to observe the therapeutic effect of Jipei Dilong Ointment on rats with acute soft tissue injury caused by heavy objects and to explore its action mechanism.[Methods]Thirty six rats were randomly divided into six groups(control group,model group,high-dose Jipei Dilong Ointment group(JP-H),medium-dose Jipei Dilong Ointment group(JP-M),low-dose Jipei Dilong Ointment group(JP-L)and diclofenac group).Except for the Control group,other groups were subjected to modeling of acute soft tissue injury by the weight impact method.All administration was performed once a day for nine consecutive days.The local appearance score and activity disorder score were determined after soft tissue injury in rats.HE staining was used to detect the pathological changes of injured soft tissues in rats.RT-PCR was used to detect the relative mRNA expressions of Bax,Bcl-2,MMP-9 and TIMP-1 in injured soft tissues of rats.Western Blot was used to detect the protein expressions of MMP-9,TIMP-1,TLR4,MyD88 and NF-κB p65 in injured soft tissues of rats.Results were statistically analyzed.[Results]Compared with the model group,Jipei Dilong Ointment could significantly improve the appearance symptoms such as swelling and ecchymosis in the injured area and the movement function of the affected limb(P<0.05).It could also improve the infiltration of inflammatory cells and widening of the intermuscular space caused by injury.Among them,the JP-H group and the diclofenac group had more significant curative effects.After 9 d of administration,each administration group could significantly up-regulate the ratio of Bcl-2/Bax mRNA expression level(P<0.05 or P<0.01),and the ratio of MMP-9/TIMP-1 mRNA expression level showed a downward trend(P>0.05).The expression level of NF-κB p65 protein in each administration group was significantly decreased(P<0.01).The protein expression levels of TLR4 and MyD88 and the ratio of MMP-9/TIMP-1 protein expression level in each administration group decreased to varying degrees.Among them,the JP-H group and diclofenac group significantly decreased(P<0.05).[Conclusions]Jipei Dilong Ointment has the functions of relieving pain,swelling and inflammation.It could improve the local appearance,functional activity and tissue morphology of affected limbs in rats,and has a therapeutic effect on acute soft tissue injury in rats.Its mechanism of action might be related to the inhibition of TLR4/MyD88/NF-κB p65 signaling pathway and the regulation of Bcl-2/Bax and MMP-9/TIMP-1 balance.

Toll样受体4信号通路过度激活在大鼠激素性股骨头坏死中的作用

目的建立大鼠激素性股骨头坏死模型并研究Toll样受体4(TLR4)信号通路在激素性股骨头坏死中的作用机制。方法成年雄性SD大鼠随机分为模型组、干预组,每组各24只,按照甲强龙20mg/kg的剂量给予双侧臀大肌交替肌注造模,1周1次,共8周。其中干预组在每次激素注射后,同时给予10mg/kg TAK242药物静脉注射;另12只大鼠设为对照组,仅在同等条件下给予生理盐水肌注。在激素注射后的8、10、12周时分别以过量麻醉法处死各组动物,采用ELISA测定血清中抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的含量,并对股骨头进行组织病理学观察和TRAP特异性染色观察。分别提取各组大鼠股骨头总mRNA和总蛋白,采用RT-PCR和Western blot技术检测TLR4、髓样细胞分化因子88(MyD88)、NF-κB p65和单核细胞趋化蛋白(MCP-1)的mRNA及蛋白的表达。结果模型组股骨头坏死的组织病理学表现明显,其中血清TRAP含量、TRAP特异性染色面积、各因子的mRNA和蛋白含量表达均较其他两组有统计学差异(P<0.05)。干预组与空白对照组的各指标检测结果差异均无统计学意义(P>0.05)。结论大剂量激素的使用可以引起TLR4信号通路过度激活从而介导激素性股骨头坏死的发生。

异荭草苷对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠的影响及机制

目的:探究异荭草苷对慢性阻塞性肺疾病(COPD)的作用及机制。方法:36只大鼠随机分为对照组、模型组、异荭草苷低、中、高剂量组和地塞米松组,除对照组外,其余组采用香烟烟雾暴露+脂多糖(LPS)法建立COPD大鼠模型,药物干预14 d后,称重计算肺指数,HE染色检测肺组织病理损伤,Smith评分法进行肺损伤评分,肺功能检测仪检测肺活量(FVC)、一秒用力呼气容积(FEV_(1))、一秒率(FEV_(1)/FVC),血气分析仪检测动脉氧分压(PaO_(2))、血氧饱和度(SaO_(2))、动脉二氧化碳分压(PaCO_(2)),ELISA检测肺组织炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-8水平,试剂盒检测肺组织氧化应激指标MDA和SOD含量,Western blot检测Toll-样受体4(TLR4)、髓样分化因子(MyD88)、核因子-κB p65(NF-κB p65)及p-NF-κB p65蛋白水平,并计算p-NF-κB p65/NF-κB p65。结果:与对照组比较,模型组肺组织出现炎症浸润,肺泡严重塌陷,肺泡壁增厚,肺间质水肿;与模型组比较,异荭草苷中、高剂量组和地塞米松组大鼠肺组织病理损伤明显改善,肺指数和肺损伤评分显著降低(P<0.05),肺功能指标FVC、FEV_(1)、FEV_(1)/FVC显著升高(P<0.05),血气分析指标PaO_(2)水平和SaO_(2)百分比显著升高(P<0.05),PaCO_(2)水平显著降低(P<0.05),肺组织IL-6、IL-1β、IL-8、TNF-α、MDA水平降低(P<0.05),SOD水平升高(P<0.05),TLR4、MyD88蛋白表达下调(P<0.05),p-NF-κB p65/NF-κB p65降低(P<0.05)。结论:异荭草苷可能通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB p65减少炎症因子分泌,降低氧化应激水平,改善COPD大鼠肺功能,缓解肺损伤。

桑叶水提物对db/db糖尿病小鼠肾脏的保护作用及其机制

目的:观察桑叶水提物(MLE)对db/db糖尿病小鼠肾脏的保护作用,并探讨其机制。方法:24只雄性C57BLKS/JGpt-Leprdb/Leprdb(db/db)小鼠按空腹血糖(FBG)值随机分为模型组、二甲双胍组、桑叶水提物低剂量(MLE-L)组和桑叶水提物高剂量(MLE-H)组,每组6只;另设6只C57BLKS/JGpt同窝野生型(m/m)小鼠作为正常组。各给药组小鼠灌胃相应药物,正常组和模型组小鼠均给予等体积去离子水,每日灌胃1次,连续给药8周。测定小鼠体质量、双侧肾脏绝对重量、FBG,并进行口服葡萄糖耐量实验(OGTT),苏木素-伊红染色、过碘酸雪夫染色观察肾脏组织病理变化,检测血清肌酐(SCr)、血清尿素氮(BUN)含量,酶联免疫吸附测定法检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和尿微量白蛋白(U-mAlb)含量,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测肾组织Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子88(MyD88)、核转录因子-κB p65(NF-κB p65)蛋白表达水平。结果:与正常组比较,模型组小鼠体质量、肾脏绝对重量、FBG、OGTT曲线下面积(AUC)显著升高(P<0.01),SCr、BUN、U-mAlb含量显著升高(P<0.01),血清TNF-α、IL-6含量显著升高(P<0.01),肾组织出现肾小球基底膜增厚,炎性细胞浸润明显,肾组织TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。与模型组比较,各给药组小鼠体质量差异无统计学意义;MLE-H组、二甲双胍组小鼠肾脏绝对重量明显降低(P<0.05,P<0.01);第4~8周二甲双胍组、MLE-L组、MLE-H组FBG明显降低(P<0.05,P<0.01);MLE-H组、二甲双胍组小鼠AUC显著降低(P<0.01),MLE-L组小鼠AUC呈下降趋势,差异无统计学意义;MLE-H组、二甲双胍组小鼠SCr、BUN、U-mAlb含量显著降低(P<0.01),MLE-L组小鼠SCr、U-mAlb含量显著降低(P<0.01);MLE-H组、二甲双胍组小鼠血清TNF-α、IL-6含量显著降低(P<0.01);各给药组小鼠肾组织病变均得到不同程度改善;MLE-H组小鼠肾组织TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达水平明显降低(P<0.05,P<0.01)。结论:桑叶水提物可改善db/db糖尿病小鼠肾组织结构和功能,其机制可能与抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路有关。

黄芪甲苷对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的防治作用

目的:探讨黄芪甲苷(AST-Ⅳ)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠的防治作用及作用机制。方法:C57BL/6雌性小鼠18只,采用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白多肽35-55(MOG35-55)诱导建立EAE模型,随机分为EAE对照组,AST-Ⅳ高、低剂量组。造模的第3天起,进行注射用药,持续25d。EAE对照组腹腔注射PBS;AST-Ⅳ高、低剂量组分别腹腔注射AST-Ⅳ溶液30、15mg·kg^-1·d^-1;各组小鼠每次给药0.2mL/只,隔天记录体质量变化。HE染色检测脊髓炎细胞浸润。流式细胞术检测脾中CD_4^+T淋巴细胞表型的表达情况。Western Blot法检测脊髓TLR4、Myd88、NF-κB/p65的表达变化。结果:与EAE对照组比较,AST-Ⅳ高剂量组可显著降低平均最高临床评分(P<0.01),减轻EAE临床症状;抑制脊髓炎性细胞浸润;显著增加CD_(25)^+和TGF-β^+的CD_4^+T细胞亚群的比例(P<0.01),降低CD_4^+IL-17^+的比例(P<0.01),明显抑制TLR4、Myd88、NF-κB/p65在脊髓的表达(P<0.05,P<0.01)。结论:AST-Ⅳ可能通过调节Th17细胞与Treg细胞两者之间的平衡和调节炎性通路减轻EAE的发病程度。