基于TLR4/TNF⁃α/MMP⁃9信号通路研究马钱子水提物改善类风湿关节炎大鼠疼痛的作用机制

基于Toll样受体4(Toll⁃like receptors 4,TLR4)/肿瘤坏死因子⁃α(tumor necrosis factor⁃α,TNF⁃α)/基质金属蛋白酶⁃9(matrix metalloproteinase⁃9,MMP⁃9)信号通路探索马钱子水提物(aqueous extract of Strychni Semen,SA)改善类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)大鼠疼痛的作用机制。首先通过TCMSP、TCMID、ETCM等数据库以及相关文献查找马钱子的主要化学成分;借助TargetNet和SwissTargetPrediction等数据库查找马钱子化学成分的主要作用靶点;通过GeneCards、OMIM和TTD等数据库获取RA和疼痛的主要靶点;Venny 2.1.0平台获取三者的交集靶点;利用STRING平台和Cytoscape 3.6.1软件构建蛋白互作网络。随后利用AutoDock Vina软件进行分子对接验证。最后建立Ⅱ型胶原诱导型关节炎(typeⅡcollagen⁃induced arthritis,CIA)大鼠模型,up⁃down法和丙酮法检测大鼠机械痛敏及冷痛敏反应,评价SA对CIA大鼠的镇痛作用;通过苏木素⁃伊红(hematoxylin⁃eosin,HE)染色评价CIA大鼠关节组织病理学变化。采用免疫组织化学法、蛋白免疫印迹法(Western blot)检测关键靶点蛋白的表达水平,实时荧光定量聚合酶链式反应法(real⁃time PCR)检测关键靶点mRNA的表达水平。网络预测结果表明,马钱子可能通过作用于TLR4/TNF⁃α/MMP⁃9信号通路发挥镇痛作用。进一步分子对接结果显示,SA主要活性成分马钱子碱与TLR4、TNF⁃α、MMP⁃9蛋白受体均有较强结合能力。实验验证结果显示,SA对CIA大鼠的机械刺激痛敏及丙酮刺激冷痛敏反应均具有较好的改善作用(P<0.05,P<0.01),且可显著降低CIA大鼠关节组织病理学评分(P<0.01);此外,SA中、高剂量可显著降低TNF⁃α、TLR4、MMP⁃9蛋白和mRNA表达水平(P<0.05,P<0.01)。综上,SA对CIA大鼠机械刺激痛敏、丙酮刺激冷痛敏反应及关节组织病理改变均具有较好的改善作用,其作用机制可能与抑制TLR4/TNF⁃α/MMP⁃9信号通路过度活化有关。