基于TLR4/TNF⁃α/MMP⁃9信号通路研究马钱子水提物改善类风湿关节炎大鼠疼痛的作用机制

基于Toll样受体4(Toll⁃like receptors 4,TLR4)/肿瘤坏死因子⁃α(tumor necrosis factor⁃α,TNF⁃α)/基质金属蛋白酶⁃9(matrix metalloproteinase⁃9,MMP⁃9)信号通路探索马钱子水提物(aqueous extract of Strychni Semen,SA)改善类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)大鼠疼痛的作用机制。首先通过TCMSP、TCMID、ETCM等数据库以及相关文献查找马钱子的主要化学成分;借助TargetNet和SwissTargetPrediction等数据库查找马钱子化学成分的主要作用靶点;通过GeneCards、OMIM和TTD等数据库获取RA和疼痛的主要靶点;Venny 2.1.0平台获取三者的交集靶点;利用STRING平台和Cytoscape 3.6.1软件构建蛋白互作网络。随后利用AutoDock Vina软件进行分子对接验证。最后建立Ⅱ型胶原诱导型关节炎(typeⅡcollagen⁃induced arthritis,CIA)大鼠模型,up⁃down法和丙酮法检测大鼠机械痛敏及冷痛敏反应,评价SA对CIA大鼠的镇痛作用;通过苏木素⁃伊红(hematoxylin⁃eosin,HE)染色评价CIA大鼠关节组织病理学变化。采用免疫组织化学法、蛋白免疫印迹法(Western blot)检测关键靶点蛋白的表达水平,实时荧光定量聚合酶链式反应法(real⁃time PCR)检测关键靶点mRNA的表达水平。网络预测结果表明,马钱子可能通过作用于TLR4/TNF⁃α/MMP⁃9信号通路发挥镇痛作用。进一步分子对接结果显示,SA主要活性成分马钱子碱与TLR4、TNF⁃α、MMP⁃9蛋白受体均有较强结合能力。实验验证结果显示,SA对CIA大鼠的机械刺激痛敏及丙酮刺激冷痛敏反应均具有较好的改善作用(P<0.05,P<0.01),且可显著降低CIA大鼠关节组织病理学评分(P<0.01);此外,SA中、高剂量可显著降低TNF⁃α、TLR4、MMP⁃9蛋白和mRNA表达水平(P<0.05,P<0.01)。综上,SA对CIA大鼠机械刺激痛敏、丙酮刺激冷痛敏反应及关节组织病理改变均具有较好的改善作用,其作用机制可能与抑制TLR4/TNF⁃α/MMP⁃9信号通路过度活化有关。

麻杏石甘汤调控TLR4/NF-κB信号通路治疗慢性阻塞性肺疾病的机制

目的:探讨麻杏石甘汤通过调控Toll样受体4(Toll-like receptor 4 polypeptide,TLR4)/核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)信号通路治疗慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)的机制。方法:将36只SD大鼠随机分成正常组、模型组、治疗组,每组12只。除正常组外,模型组和治疗组采用烟熏联合气管内滴入脂多糖的方法制备COPD大鼠模型。正常组及模型组正常饲养,治疗组予以麻杏石甘汤灌胃治疗,共干预4周。采用肺功能仪检测大鼠肺功能[吸气阻力(inspiratory resistance,Ri)、呼气阻力(respiratory resistance,Re)和肺组织顺应性(dynamic lung compliance,Cdyn)];采用HE染色观察各组肺组织形态;采用Western blot检测基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinases-9,MMP-9)、TLR4、NF-κB p65蛋白相对表达量;采用ELISA法检测炎症因子白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)和白细胞介素18(interleukin-18,IL-18)的表达。结果:模型组和治疗组Ri、Re显著高于正常组(P<0.05),Cdyn显著低于正常组(P<0.05);治疗组Ri、Re显著低于模型组(P<0.05),Cdyn显著高于模型组(P<0.05)。HE染色显示,正常组肺组织结构正常;模型组肺组织中较多炎性粒子浸润,肺组织结构破坏严重;治疗组肺组织形态较模型组明显改善。Western blot显示,模型组和治疗组MMP-9、TLR4、NF-κB p65蛋白相对表达量显著高于正常组(P<0.05);治疗组MMP-9、TLR4、NF-κB p65蛋白相对表达量低于模型组(P<0.05)。ELISA结果显示,模型组和治疗组IL-6和IL-18含量显著高于正常组(P<0.05),治疗组IL-6和IL-18含量显著低于模型组(P<0.05)。结论:麻杏石甘汤通过抑制TLR4/NF-κB信号通路,减少炎性细胞浸润及MMP-9的表达,从而改善COPD症状。

经筋微创松解疗法联合嘎日迪-15味丸对膝骨性关节炎患者TLR4/MyD88/NF-κB信号转导通路及TGF-β_1水平的影响

目的:探讨经筋微创松解疗法联合嘎日迪-15味丸对膝骨性关节炎(KOA)患者TLR4/MyD88/NF-κB信号转导通路及转化生长因子β_1(TGF-β)1水平的影响。方法:将KOA患者98例(98膝)随机分为2组各49例,对照组给予嘎日迪-15味丸治疗,实验组在对照组基础上给予经筋微创松解疗法,疗程均为2个月;观察2组治疗效果,比较2组治疗前后膝关节WOMAC评分、关节液中前列腺素E_2(PGE)2、基质金属蛋白酶-9 (MMP-9)、TGF-β_1水平、关节软骨中Toll样受体4 (TLR4)、髓样分化因子(MyD88)、核因子κB (NF-κB)蛋白表达。结果:总有效率实验组为89.90%,对照组为71.43%,2组比较,差异有统计学意义(P <0.05)。治疗后2组功能、关节疼痛、僵硬等评分均较治疗前降低(P <0.05),且实验组各项评分均低于对照组(P <0.05)。治疗后2组关节积液TGF-β_1、PGE_2、MMP-9水平均较治疗前降低(P <0.05),且实验组各项指标水平均低于对照组(P <0.05)。治疗后2组关节软骨MyD88、TLR4、NF-κB蛋白表达水平较治疗前降低,且实验组各项指标水平均低于对照组(P <0.05)。结论:经筋微创松解疗法联合嘎日迪-15味丸治疗KOA疗效显著,其作用机制可能与降低MyD88、TLR4、NF-κB蛋白表达及TGF-β_1、PGE_2、MMP-9水平有关。

益母草碱预处理对大鼠缺氧/复氧心肌细胞存活能力及TLR4/NF-κB通路蛋白表达的影响

目的:探讨益母草碱预处理对大鼠缺氧/复氧心肌细胞存活能力的影响及潜在的分子机制。方法:大鼠心肌细胞H9c2分为3组。正常对照组细胞常规培养;缺氧/复氧组细胞采用缺氧3 h、复氧2 h方法诱导损伤;益母草碱组细胞先以20μmol/L的益母草碱预处理24 h,然后进行缺氧/复氧处理。采用CCK-8法检测3组细胞存活能力,AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡,ELISA法检测细胞培养上清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和IL-6含量,Western blot法检测细胞中Cleaved Caspase-3、Toll样受体4(TLR4)、核因子-κB(NF-κB)和抑制蛋白IκBα的表达。结果:与正常对照组比较,缺氧/复氧组心肌细胞存活率下降,凋亡率升高,TNF-α、IL-1β和IL-6分泌量增加,细胞中Cleaved Caspase-3、TLR4和NF-κB蛋白表达上调,IκBα蛋白表达下调(P<0.05)。与缺氧/复氧组比较,益母草碱组细胞存活率升高,细胞凋亡率下降,TNF-α、IL-1β和IL-6分泌量降低,细胞中Cleaved Caspase-3、TLR4、NF-κB蛋白表达下调,IκBα蛋白表达上调(P<0.05)。结论:益母草碱可通过抑制TLR4/NF-κB信号通路,减轻缺氧/复氧心肌细胞损伤。

乌梅丸及其拆方对溃疡性结肠炎大鼠炎性因子及TLR9/MyD88/NF-κBp65信号通路的影响

目的:探讨乌梅丸及其拆方对溃疡性结肠炎(UC)大鼠炎性因子及TLR9/My D88/NF-κBp65信号通路的影响,并分析其作用机制。方法:大鼠随机分为正常组、模型组、柳氮磺吡啶组、乌梅丸组、乌梅丸辛开苦降组、乌梅丸辛开组、乌梅丸苦降组、乌梅丸补益组。三硝基苯磺酸/乙醇法造模2d后给药4周,观察大鼠疾病活动指数(DAI)及结肠黏膜损伤程度,ELISA法检测结肠黏膜白介素-4(IL-4)、干扰素-γ(INF-γ)水平,免疫组化法观察Toll样受体9(TLR9)、髓样分化因子88(My D88)、细胞核因子κBp65(NF-κBp65)的表达。结果:乌梅丸组、乌梅丸辛开苦降组均能显著升高IL-4,降低INF-γ水平,显著减少结肠黏膜TLR9、My D88、NF-κBp65的蛋白表达(P<0.01),且效果优于其它乌梅丸拆方组。结论:乌梅丸组、乌梅丸辛开苦降组对UC大鼠结肠黏膜炎症有较好的缓解作用,其作用机制可能与调节炎性因子平衡,抑制TLR9/My D88/NF-κBp65信号通路的异常活化有关;辛开苦降、寒温并施的配伍方式可能是乌梅丸治疗UC的内在机制之一。